经典Wnt信号通路在骨肉瘤中的作用机制

黄为，唐富平，李祖德，叶来生

(1.广西中医药大学研究生院，南宁 530001； 2.广西中医药大学附属瑞康医院肿瘤科，南宁 530011)

骨肉瘤是一种由间质细胞发展而来的恶性骨肿瘤，主要侵袭关节周围，以胫骨近端和股骨远端的长骨干骺端多见，其发病高峰年龄为15～19岁[1]。临床上骨肉瘤发展以隐匿性、生长迅速、肿瘤细胞过度增殖以及较强的侵袭性和转移性为主要特征，且能够通过血行转移到肺和胸膜[2]，严重危及患者的生命。目前骨肉瘤治疗方法主要包括免疫治疗(主动特异性免疫治疗和非特异性免疫治疗)、基因和手术治疗等，联合应用阿霉素、大剂量氨甲蝶呤、顺铂等化疗药物患者的5年生存率达60%～70%[3-4]，但药物的毒性作用可导致患者耐受性差，甚至引起溶血、肝肾功能损害。因此，临床缺乏治愈骨肉瘤的有效手段。近年研究发现，Wnt信号通路参与骨肉瘤的生长、增殖以及侵袭转移，并能促使骨肉瘤的耐药和再生，在骨肉瘤发生和发展过程中扮演重要角色[5]。

异常的Wnt信号通路能够增强C-myc基因、细胞周期蛋白D1(CyclinD1)等致癌基因的表达，从而诱导骨肉瘤的发生[6]。因此，充分了解Wnt信号通路在骨肉瘤中的作用机制，找出靶向治疗骨肉瘤增殖和侵袭的手段和方法，可能成为抑制骨肉瘤发生、发展的关键。现就经典Wnt信号通路在骨肉瘤发生发展、细胞凋亡、侵袭转移等中的作用予以综述。

1 经典Wnt信号通路的组成及机制概述

Wnt信号通路是一条高度保守的生长因子家族信号通路，是细胞间信号转导的关键通路之一。它分为4个不同的通路，分别为Wnt/β联蛋白(β-catenin)通路、Wnt/Ca2+通路、Wnt/平面细胞极性通路及Wnt/蛋白激酶A通路[7]，而经典Wnt信号通路即Wnt/β-catenin通路是目前研究最广泛、最重要的Wnt信号通路，它通过调节β-catenin驱动靶基因的激活，并调节多种生物的生长发育过程。

目前认为，经典Wnt信号通路通常由以下几种成分组成：Wnt蛋白(Wnt配体)、Wnt受体蛋白[卷曲蛋白(Frizzled，FZD)家族及低密度脂蛋白受体相关蛋白(low-density lipoprotein receptor related protein，LRP)]、糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)、酪蛋白激酶 1、DvL(Dishevelled)蛋白、β-catenin、T细胞因子、淋巴增强因子家族及其下游靶基因(c-Myc、CyclinD1、Survivin等)。另外，经典Wnt信号通路的作用机制为在存在合适Wnt配体的情况下，Wnt与FZD家族的7种跨膜受体和LRP5/6结合形成三聚体，使细胞内DvL蛋白激活，DvL蛋白的激活导致GSK-3β的抑制，从而使β-catenin不被GSK-3β磷酸化，β-catenin在细胞质内大量积聚并促进其向细胞核转运，β-catenin作为整条信号通路的关键枢纽分子，在细胞核内与T细胞因子/淋巴增强因子形成复合体，引起下游靶基因(c-Myc、CyclinD1、Survivin等)的转录，进而导致细胞的异常增殖及组织分化，诱导肿瘤形成[8](图1)。

注：Frizzled为卷曲蛋白，LRP5/6为低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6，DvL为Dishevelled，GSK-3β为糖原合成酶激酶-3β，CyclinD1为细胞周期蛋白D1，β-catenin为β联蛋白，TCF为T细胞因子，LEF为淋巴增强因子

Wnt信号通路具有调控肿瘤细胞的增殖、分化、凋亡及侵袭等生物学功能。研究证实，Wnt/β-catenin通路与骨肉瘤的发生发展密切相关[9]。同时有研究表明，Wnt/β-catenin通路的异常激活与肺癌、乳腺癌、结肠癌、鼻咽癌等有关[10-11]。

2 经典Wnt信号通路与骨肉瘤的发生发展

2.1Wnt蛋白与骨肉瘤的发生发展 Wnt是一种分泌型糖蛋白，具有分泌的N端信号肽，并在调节发育过程和成人组织稳态中起重要作用。其Wnt配体是独特的，可以激活不同受体介导的信号转导通路。目前发现19种Wnt蛋白中至少有7种(Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt8和Wnt10b)在Wnt/β-catenin信号通路中发挥作用[12]。此外，在骨肉瘤细胞株中发现了Wnt1、Wnt4、Wnt5a、Wnt7a和Wnt14蛋白的存在；在Wnt相关基因中，4个细胞株中有2个细胞株表达高度转化的Wnt1，3/4的细胞株表达Wnt4，而所有细胞株均表达弱转化的Wnt5a和Wnt7a[13]，因此Wnt配体蛋白与骨肉瘤的发生发展有密切联系。

目前，已证实两种人骨肉瘤细胞中存在多个Wnt配体(即Wnt2b、Wnt3、Wnt5a和Wnt14)和受体(即FZD1、FZD2、FZD3、FZD6、FZD7、LRP5和LRP6)的表达。此外，Chen等[14]在44例骨肉瘤样本中发现，至少有75%的骨肉瘤患者存在Wnt10b表达，患者生存率呈显著降低趋势。以上研究证实，Wnt蛋白与骨肉瘤密切相关，因此通过靶向干预上游Wnt蛋白，阻断β-catenin信号通路相关因子传入下游，可能有利于防止骨肉瘤的发生。

2.2β-catenin与骨肉瘤 β-catenin作为经典Wnt信号通路中实现细胞核内外信号转导的关键信号因子，通常在细胞中保持低水平状态。目前发现其在细胞的增殖、分化和凋亡等方面起重要的调节作用[15]。Wnt信号通路的异常激活会导致复合体破坏，使细胞中上皮钙黏素的表达水平下降，进而调节波形蛋白促进移动蛋白上调，造成细胞失去极性，细胞间的连接变得疏松，导致通路中的细胞黏附力下降，从而影响骨肉瘤的转移及发生发展[16]。Xu等[17]的研究表明，骨髓间充质干细胞中的短链脱氢还原酶12抗体可以与β-catenin形成复合物，从而稳定细胞表面的β-catenin，导致Wnt信号通路失活，进一步抑制骨肉瘤细胞的增殖、迁移与侵袭，诱导骨肉瘤的凋亡。Liu等[18]研究证明，细胞增殖上调因子4与肿瘤发展和临床分型密切相关，其在骨肉瘤细胞中高表达，通过GSK-3β/β-catenin/CyclinD1通路调节细胞周期，从而影响骨肉瘤细胞的增殖。因此β-catenin是该通路影响细胞分化功能的重要中间环节，然而目前部分研究仍停留在初级理论阶段，需要更多的研究证实。

2.3LRP5/6与骨肉瘤 LRP5及其密切相关同源物LRP6是介导Wnt/β-catenin通路的两个重要分子，目前已有研究表明两者与原发性骨肉瘤的发生发展密切相关[19]。

FZD与LRP5/6作为Wnt蛋白的共受体，可以被来自Dkk(Dickkopf)家族的分泌蛋白拮抗，然后分泌蛋白与LRP5或LRP6以高亲和力结合，从而抑制Wnt信号通路相关因子，起到抑制肿瘤发生发展的作用[20]。Guo等[21]在实验中发现，可溶性显性阴性LRP5阻断了骨肉瘤细胞中的经典Wnt信号通路，并抑制Met和基质金属蛋白酶等癌症相关标志物，从而降低骨肉瘤的致瘤性和转移性。Yang等[22]将LRP6过表达载体转导到骨肉瘤细胞(MG63)中，发现LRP6的过表达消除了微RNA(microRNA，miRNA/miR)-183诱导的Wnt/β-catenin通路失活，从而抑制骨肉瘤细胞上皮-间充质转化，最终阻止骨肉瘤细胞的生长、侵袭，减少骨肉瘤的发生。因此靶向干预 Wnt蛋白、LRP5/6等上游的相关靶基因，可能是治疗骨肉瘤的一种潜在有效方法。虽然目前有研究对通过经典Wnt信号通路治疗骨肉瘤进行了探讨，但缺少有价值的数据验证，未来仍需大量证据证实经典Wnt信号通路中FZD、LRP5/6对骨肉瘤发生发展的影响。

3 经典Wnt信号通路与骨肉瘤细胞凋亡

细胞凋亡是由基因控制的细胞发生有序的自我消亡，在维持内环境稳定、正常生长发育、细胞分化等过程中起重要作用。近年研究证实，经典Wnt信号通路与骨肉瘤细胞的形成、迁移和凋亡密切相关[23-24]。

Survivin是凋亡抑制蛋白家族的成员，具有肿瘤特异性，与肿瘤细胞的分化、增殖及侵袭转移密切相关[25]。Survivin蛋白通过抑制胱天蛋白酶(caspase) 3和caspase-7的活性，从而起到抑制细胞凋亡的作用[26]。同时，Survivin也通过P21蛋白间接抑制caspase。在细胞增殖分化的诱导下，Survivin表达明显增强，其与细胞周期蛋白依赖性激酶4(cyclin-dependent kinase 4，CDK4)结合形成Survivin-CDK4复合物，使P21蛋白从Survivin-CDK4复合物中释放出来，并引导其与线粒体caspase-3前体结合，致使caspase-3活性降低，从而进一步阻止线粒体释放细胞色素C，最终抑制细胞凋亡[27]。另外，Survivin也是经典Wnt信号通路的下游靶基因，β-catenin在肿瘤细胞中的表达显著增加，可以使Survivin表达水平升高[28]，同时Survivin与β-catenin可能共同作用于Wnt/β-catenin信号通路来影响肿瘤的转化过程，并促进细胞增殖，进而发挥抑制细胞凋亡的作用(图2)。Tan等[29]在骨肉瘤细胞实验模型中发现，二氢丹参酮Ⅰ能使骨肉瘤细胞中caspase-3蛋白表达水平明显上调，而β-catenin和c-Myc蛋白表达水平明显下调，从而抑制Wnt信号转导通路，减少骨肉瘤细胞增殖并诱导其凋亡，最终减少骨肉瘤的发生。黄华坤等[30]研究发现，穿心莲内酯可通过抑制Wnt信号通路的活性，使β-catenin和c-Myc表达水平均明显下调，且凋亡相关蛋白caspase-3水平下降而抗凋亡蛋白Bcl-2表达升高，进而抑制骨肉瘤细胞迁移和侵袭并促进其凋亡。以上研究均表明，Survivin、caspase、c-Myc等在维持正常的细胞分化功能中发挥重要作用，同时在骨肉瘤发生、发展的过程中也起着直接或间接作用。由此认为，针对Survivin、caspase、c-Myc等因子的靶向治疗药物是骨肉瘤治疗的新途径，其相关作用机制应进行深入探讨。

注：β-catenin为β联蛋白，caspase为胱天蛋白酶，CDK4为细胞周期蛋白依赖性激酶4，pro为前体

4 经典Wnt信号通路与骨肉瘤的耐药性

近年来，随着医疗和分子生物技术的进步，骨肉瘤的诊断和治疗取得了很大进展，但多药耐药仍是该病进一步恶化的主要因素[31]。多药耐药是指肿瘤细胞对相关化疗药物产生耐药性的同时，对其他未接触过且结构和功能不相同的药物也会产生一定的耐药性[32]。因此，如果能够明确化疗药物的作用机制，将有利于提高骨肉瘤耐药患者的靶向治疗效果。

已有研究表明，经典Wnt信号通路主要通过加快骨肉瘤细胞的增殖、分化、侵袭与转移等诱导骨肉瘤多药耐药的产生[33]。此外β-catenin作为Wnt信号通路的核心蛋白，当Wnt信号通路被异常激活时，β-catenin在胞质中的活性持续升高，导致其向细胞核内转移，并与核内T细胞因子/淋巴增强因子结合，进而激活相关耐药基因(包括c-Myc、CyclinD1等)的表达[34]，最终造成细胞的异常增殖分化(图3)。因此认为，通过靶向抑制Wnt信号通路可减少肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭，从而防止骨肉瘤多药耐药的发生。

注：β-catenin为β联蛋白，CyclinD1为细胞周期蛋白D1，TCF为T细胞因子，LEF为淋巴增强因子

Zhang等[35]研究发现，circ_001569的敲除显著抑制骨肉瘤细胞的增殖能力，而上调circ_001569能通过激活Wnt/β-catenin信号通路，促进骨肉瘤细胞对顺铂的耐药性。Martins-Neves等[36]研究表明，化疗药物可显著增强骨肉瘤细胞内Wnt/β-catenin信号通路的转导活性，上调耐药蛋白ATP结合盒亚家族G成员2的表达，从而使化疗失败，并增强细胞内干细胞转录因子的表达，赋予其肿瘤干细胞的特征。综上可知，Wnt/β-catenin信号通路与骨肉瘤的发生、发展和药物化疗效应有密切联系，它可以促进骨肉瘤细胞增殖、迁移以及化疗耐药性。但目前没有足够的证据支持Wnt/β-catenin信号通路治疗骨肉瘤的作用机制，需要更多的实验数据及临床证据证实。

5 经典Wnt信号通路与骨肉瘤侵袭转移

癌症转移是肿瘤进一步发展的关键因素，也是导致癌症患者死亡的重要原因之一。骨肉瘤具有高度的局部侵袭和远处转移倾向，其转移主要发生在肺部和骨骼[37]，据报道早期肺转移患者的5年生存率仅为20%左右[38]。在经典Wnt信号通路中，β-catenin作为关键的调控因子广泛存在于细胞质及细胞膜上，β-catenin磷酸化后可被泛素化，同时可通过蛋白酶进行降解，从而使β-catenin的表达活性降低，阻止下游靶基因的转录。当细胞外有Wnt受体时，被β-catenin磷酸化的Axin复合体稳定性下降，进而导致β-catenin磷酸化受到明显抑制并在体内不断集聚增殖，最终造成目标基因转录。因此Wnt信号通路加快了大多数癌症的发生发展，有研究证实β-catenin的表达活性与肿瘤的浸润发展、淋巴结的远处转移、肿瘤细胞的分化、恶变程度等呈正相关[39]。

裸露角质蛋白同源物2是Wnt/β-catenin信号通路的调节因子，其上调降低了骨肉瘤细胞在体外的迁移和侵袭能力，并抑制体内的肿瘤转移[40]。此外在肿瘤异种移植模型实验中发现，敲除HOXB8有效降低了骨肉瘤细胞中β-catenin、CyclinD1和c-Myc的表达水平，从而抑制Wnt信号通路，进而减少骨肉瘤细胞的增殖、迁移与侵袭[41]；Jin等[42]研究表明，miR-135b通过骨肉瘤细胞中的TET3、CK1A和GSK-3β来激活Notch和Wnt信号通路，同时抑制这些信号网络的多个负调节因子，进而刺激骨肉瘤细胞的肺转移、复发和干细胞发展。而拮抗miR-135b可导致Wnt和Notch信号同时失活，并对转移、肿瘤干细胞诱导的肿瘤发生和异种移植模型中骨肉瘤的复发产生显著抑制作用。总之，基于Wnt/β-catenin信号通路在骨肉瘤中的作用机制，通过靶向抑制Wnt信号通路，对骨肉瘤的防治具有重要的临床意义。

6 小结与展望

Wnt信号通路在骨肉瘤中的作用机制是骨科领域研究常见的问题之一，其机制尚不明确。经典Wnt信号通路在骨肉瘤细胞的凋亡、侵袭转移以及化疗耐药性等方面均起重要的调控作用，且Wnt信号通路中的相关蛋白(包括Wnt蛋白、LRP5/6、β-catenin等)与骨肉瘤的发生发展有密切联系。

通过靶向干预经典Wnt信号通路的相关靶点来调节其信号通路，从而改变通路中蛋白水平的表达，最终影响Wnt信号通路调控的生物学效应，为骨肉瘤的靶向治疗提供了新的理论研究方向。截至目前，关于骨肉瘤的发病机制尚不清楚，仍有许多具体调控机制处于实验和探索阶段。如Wnt信号通路中分子调控机制与骨肉瘤细胞之间的关系还需进一步探索；非经典Wnt信号通路在骨肉瘤中的作用还不够明确，也未得到充分的证实。此外，Wnt信号通路可调控骨髓间充质干细胞的分化表达，促进骨形成，而对Wnt信号通路的抑制是否会引起骨丢失、脆性骨折也需要进一步的研究。由于骨肉瘤的发病机制复杂多样，未来的研究中应继续深入阐明Wnt信号通路对骨肉瘤发生发展的具体机制，以为临床治疗骨肉瘤提供可行性方案。