天水秋椒叶黄酮的提取工艺优化

刘晓莹，卢利平，2，金伟嘉，李佳怡，杨 扬

（1.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学生物医学研究中心中国马来西亚国家联合实验室，甘肃 兰州 730030）

0 引言

花椒（Zanthoxylum bungeanum）是芸香科植物，一种历史久远的食物香料[1]。中国是世界花椒栽培面积与产量最大的国家[2]，在我国分布广泛，北起东北南部，南至五岭北坡，东南至江苏、浙江沿海地区，西南至西藏东南部，常见于平原至海拔较高的山地，在青海海拔2 500 m的坡地也有栽种；耐旱、喜阳光，各地多栽种[3]。随着政府部门精准扶贫工作力度的不断加大和花椒价格高、效益好，甘肃省天水市甘谷县将花椒栽植作为贫困山区精准扶贫精准脱贫产业富民的主要产业来培育，栽植面积逐年扩大[4]。秋椒作为当地特有花椒品种也随栽植面积的扩大而增产增收，其花椒叶作为花椒的主要副产物，也是很好的调味品[5]，具有抗菌、活血、止痛等药用价值[6-7]。且花椒叶化学成分组成丰富，近年来国内外对花椒叶的研究表明，花椒叶的主要成分为挥发油、黄酮、多酚、多糖、酰胺、香豆素等。丰富的化学组成使其具有多种生物活性，拥有良好的药用价值，具有广阔的研究前景[8]。人类心脑血管疾病、肿瘤、老年性痴呆、震颤麻痹症等疾病几乎都与氧自由基有关[9]。但花椒叶一直没有得到良好的利用，造成了一定的资源浪费[10]。黄酮是一种很强的抗氧化剂，可有效清除体内的氧自由基，可以改善血液循环、降低胆固醇[11]，大大降低了心脑血管疾病的发病率，也可以改善心脑血管疾病的症状。黄酮类化合物具有很强的抑菌活性[12]。此外，黄酮类化合物具有降血糖、降血脂的作用[13-15]，还可清除高眼压状态下视网膜组织中产生的自由基损害，对高眼压状态下视网膜组织具有重要的保护作用[16]。响应面法（Response surface methodology，RSM）作为一种非常重要的试验设计优化方法，在中药提取工艺优化等方面得到广泛的应用[17]。响应面法是将影响提取试验结果的因素进行设计，按照设计方案进行试验得到试验结果。分析试验因素和试验结果之间的数学关系，进而得到最优的试验条件[18-19]。关于花椒叶中黄酮的提取虽有报道，但对于天水甘谷县花椒中秋椒叶的黄酮提取未见报道。以当地秋椒叶为原料，通过超声辅助提取、单因素试验法、响应面法优化秋椒叶总黄酮的提取工艺，得到了较高的黄酮提取率，从而提高甘肃天水秋椒叶的利用率，变废为宝。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

秋椒叶，2020年5月采摘于甘肃甘谷县大象山镇；丙酮、无水乙醇、蒸馏水、亚硝酸钠、九水合硝酸铝、氢氧化钠，均为分析纯，兰州市奥科生物技术有限公司提供；芦丁标准品，Solarbio公司提供。

WJX-200型高速多功能粉碎机，江阴市亿丰机械设备有限公司产品；SB-500DTY型超声波清洗机，宁波新芝生物科技股份有限公司产品；BSM-120型电子分析天平，上海坤诚科学仪器有限公司产品；DT5型离心机，上海京工实业有限公司产品；HHS4A型电热恒温水浴锅，北京科伟永兴仪器有限公司产品；DHG-9420A型电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司产品；MHY-19642型可见分光光度计，北京美华仪科技有限公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 花椒叶总黄酮提取工艺流程图

秋椒叶干燥→粉碎过筛→脱色处理→超声提取→离心→黄酮提取液。

1.2.2 原料处理

摘取新鲜的秋椒叶洗净，在70℃烘箱中烘至恒质量。粉碎花椒叶并过80目筛，经丙酮溶液浸泡过夜，抽滤，得到脱色处理后的干燥秋椒叶粉，装入封口袋中密封保存，备用。

1.2.3 提取

准确称量1 g秋椒叶粉于比色管中，超声频率40 kHz，功率比60%，在特定体积分数的乙醇溶液、液料比、超声时间、超声温度下进行超声波辅助提取。以转速12 000 r/min离心15 min，收集提取液2次后将滤液合并，最终提取液定容至50 mL。

1.2.4 黄酮含量的测定

移取0.5 mL提取液到10 mL具塞试管中，用体积分数80%乙醇溶液补至5 mL，加入质量分数5%亚硝酸钠溶液0.3 mL，摇匀，静置6 min，加入10%Al(NO3)3溶液0.3 mL，摇匀，反应6 min，再加入质量分数4%NaOH溶液4 mL，混合均匀后用蒸馏水定容至刻度线，15 min后于波长510 nm处测定其吸光度（A510）。秋椒叶中黄酮浓度依据标准曲线推算，并计算黄酮的得率[20]。

式中：

Y——秋椒叶总黄酮得率，%；

C——测得的黄酮质量浓度，mg/mL；

V——秋椒叶样品定容体积，mL；

n——稀释倍数；

m——秋椒叶样品质量，g。

1.2.5 芦丁标准曲线的绘制

配制特定质量浓度的芦丁标准品溶液。分别吸取体积0，0.5，1.0，1.5，2.0 mL的芦丁标准品溶液置于10 mL具塞试管中，加入80%乙醇溶液定容至5 mL，混合均匀后同1.2.4操作方法进行反应后，于波长510 nm处测定其吸光度（A510）[21]。

1.3 单因素试验

按照1.2.4中的试验步骤，分别研究不同梯度单因素对秋椒叶黄酮提取率的影响。设置各单因素梯度为乙醇体积分数（45%，50%，55%，60%，65%，70%）；浸提时间（20，30，40，50，60，70 min）；浸提温度（40，45，50，55，60，65℃）；料液比（1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40，1∶45（g∶mL））。

1.4 试验因素水平选取

根据单因素试验所得的提取工艺条件，以秋椒叶黄酮得率为响应值，选取乙醇体积分数（A）、超声时间（B）、超声温度（C）、料液比（D）4个因素作为考查变量，依据如表1所示的试验因素和水平设计进行响应面试验设计，优化秋椒叶黄酮的提取工艺。

响应面试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面试验因素与水平设计

2 结果与分析

2.1 芦丁标准曲线的绘制

芦丁标准曲线见图1。

图1 芦丁标准曲线

通过标准曲线得到标准曲线方程为Y=8.687 1X+0.002 6，相关系数R2=0.999 3，且在质量浓度0.01～0.05 mg/mL范围内呈现良好的线性关系。

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇体积分数对黄酮得率的影响

乙醇体积分数对黄酮得率的影响见图2。

图2 乙醇体积分数对黄酮得率的影响

由图2可知，当乙醇体积分数为55%时，黄酮得率达到最高。依据相似相溶原理可知，黄酮溶于乙醇的量与两者极性密切相关，秋椒叶中黄酮的极性与55%的乙醇溶液相近，故此时得率为最大值。随着乙醇体积分数继续增大，黄酮得率下降。因此，根据秋椒叶黄酮得率曲线走势，选取50%，55%，60%的乙醇体积分数进行响应面优化试验设计。

2.2.2 超声时间对黄酮得率的影响

超声时间对黄酮得率的影响见图3。

由图3可知，在一定时间范围内，秋椒叶黄酮得率呈现先增加后减少的变化规律，在超声时间为50 min时，黄酮得率最高为19.51%；超过50 min后，黄酮得率曲线呈现缓慢下降趋势。根据秋椒叶黄酮得率曲线走势，超声时间选取40，50，60 min进行响应面优化试验设计。

图3 超声时间对黄酮得率的影响

2.2.3 超声温度对黄酮得率的影响

超声温度对黄酮得率的影响见图4。

由图4可知，当超声温度为40～55℃时，黄酮得率随着超声温度的上升而增大，当温度超过55℃后，秋椒叶黄酮得率开始下降。这是因为适宜的温度范围能够提高黄酮分子的运动速率，从而提高黄酮的溶出，但是高于一定的温度界限，黄酮结构被破坏，溶出量减少，其他杂质的析出比例上升，因而黄酮得率会有所降低。根据秋椒叶黄酮得率曲线走势，超声温度选取50，55，60℃进行响应面优化试验设计。

图4 超声温度对黄酮得率的影响

2.2.4 料液比对黄酮得率的影响

料液比对黄酮得率的影响见图5。

图5 料液比对黄酮得率的影响

由图5可知，在料液比为1∶20～1∶35时，黄酮得率随着料液比的升高而升高，当料液比超过1∶35后，黄酮得率呈下降趋势。这是由于料液比比较低时，秋椒叶中黄酮不能够完全溶出；随着溶剂量增加，杂质溶出量增加导致黄酮提率降低，过量的乙醇导致黄酮损失。根据秋椒叶黄酮得率曲线走向规律，料液比选取1∶30，1∶35，1∶40（g∶mL）进行响应面优化试验设计。

2.3 响应面设计结果与分析

2.3.1 响应面法试验设计结果

基于单因素试验结果，通过Design Expert 8.06软件设计，以乙醇体积分数（A）、超声时间（B）、超声温度（C）、料液比（D）为自变量，以秋椒叶黄酮得率为响应值进行响应面分析，其中25，26，27，28，29是中心试验，其余为析因试验。得到黄酮提取液的拟合回归方程为：

响应面设计方案及结果见表2。

表2 响应面设计方案及结果

回归方程方差分析见表3。

由表3可知，通过p值可知，对黄酮得率影响极显著的因素为C，A2，B2，C2，D2，说明试验因素与响应值之间，对其影响较大为二次项，四因素之间交互作用不显著。整体模型的p值＜0.01，差异极显著（p＜0.01），表明回归方程模型显著，失拟项p值为0.050 4，较显著（p＜0.05），表明该模型的拟合度较好，变异系数CV=7.74，说明试验可操作性较好。该模型的决定系数R2=0.923 0和R2Adj=0.864 5。综上所述，该模型可以用于秋椒叶中黄酮得率理论值的进一步分析和预测。通过F值可得，各因素对黄酮得率的影响次序为C＞D＞A＞B，即超声温度＞料液比＞乙醇体积分数＞超声时间。

表3 回归方程方差分析

2.3.2 响应面法试验设计

乙醇体积分数与超声时间对黄酮得率影响的响应面图见图6，乙醇体积分数与超声温度对黄酮得率影响的响应面图见图7，乙醇体积分数与液料比对黄酮得率影响的响应面图见图8，超声温度与超声时间对黄酮得率影响的响应面图见图9，超声时间与料液比对黄酮得率影响的响应面图见图10，超声温度与料液比对黄酮得率影响的响应面图见图11。

图6 乙醇体积分数与超声时间对黄酮得率影响的响应面图

图7 乙醇体积分数与超声温度对黄酮得率影响的响应面图

图8 乙醇体积分数与料液比对黄酮得率影响的响应面图

图9 超声温度与超声时间对黄酮得率影响的响应面图

图10 超声时间与液料比对黄酮得率影响的响应面图

交互效应的强弱趋向可以被响应面坡度陡峭程度和等高线椭圆形状反应，交互效应强弱水平可以从投影面的等高线形状中观察，曲面倾斜度越大，则该因素对响应值的影响越显著。对比图6～图11，超声温度对秋椒叶黄酮得率的影响最大，液料比和乙醇体积分数次之，超声时间的影响最小。各因素等高线椭圆形状不明显（图6～11b），表明其交互作用不显著，符合回归方程的方差分析结果。

图11 超声温度与液料比对黄酮得率影响的响应面图

2.4 验证试验

经过响应面结果分析得到工艺条件的最优值分别为乙醇体积分数55.04%，超声时间50.88 min，超声温度56.39℃，料液比1∶36.55（g∶mL），此时黄酮得率为25.858 8%。考虑实际操作的可行性及验证结果的准确性，将工艺参数调整为乙醇体积分数55%，超声时间50 min，超声温度56℃，料液比1∶36（g∶mL），在同等条件下进行3组重复试验，得到秋椒叶总黄酮的得率为25.76%，与预测值接近（相对误差为0.34%），说明响应面法优化秋椒叶总黄酮的提取工艺条件具有可行性。

3 结论

采用响应面法（RSM）优化了超声辅助提取秋椒叶黄酮的工艺，建立了乙醇体积分数、超声温度、超声时间和料液比对秋椒叶黄酮含量影响的回归模型。结果表明，各因素对黄酮得率的影响次序为超声温度＞料液比＞乙醇体积分数＞超声时间，由此得到最佳提取工艺条件为乙醇体积分数55%，浸提时间50 min，浸提温度56℃，料液比1∶36（g∶mL），在该条件下，大红袍花椒叶中黄酮得率达到25.76%±0.05%。秋椒叶中总黄酮含量很高，黄酮具有非常好的研究价值和医用价值，可进行更加深入的研究，提高秋椒叶的附加值，为花椒副产物的进一步开发利用提供理论参考。