四妙丸对高尿酸血症大鼠肠道尿酸排泄影响的研究❋

陈杰伟， 戴 号， 叶博闻， 张 璟， 陈觅蜜

(1.上海中医药大学， 上海 201203；2.上海中医药大学附属光华医院， 上海 200032)

高尿酸血症(hyperuricemia, HUA)是以体内嘌呤代谢紊乱、血清尿酸水平升高为临床表现的常见代谢性疾病，是痛风、高血压、脑卒中、冠心病等疾病的独立致病因素[1，2]。随着社会经济发展，饮食结构改变，我国HUA患病率逐年升高，并呈高流行、年轻化趋势，已成为第二大代谢性疾病[3]。

尿酸生成过多和/或排泄减少是HUA的主要发病机制[4]。肾脏排泄尿酸不足可致“肾脏排泄不良型”(renal underexcretion type, RUE)HUA；肠道尿酸排泄不足，导致“肾外排泄不足型”(extra-renal underexcretion type, EUE)HUA[5]。促进尿酸排泄是治疗HUA的主要手段之一，代表药物如苯溴马隆以肾脏为靶器官，通过抑制肾小管重吸收，促进肾脏尿酸排泄，但对EUE型HUA无效，甚至会继续加重肾脏负荷，引起慢性肾病等肾脏疾病[6]、肝毒性和骨髓抑制等不良反应[7]。因此，相较于单一的肾脏途径，以肠道为靶器官促进尿酸排泄，正成为新的降尿酸治疗手段。

中医药治疗高尿酸血症具有多靶点、疗效持久、副作用小等优势[8]。四妙丸源自清代《成方便读》，由苍术、盐黄柏、牛膝、薏苡仁组成，具有清热祛湿、逐瘀通经之效，是临床治疗高尿酸血症及痛风的常用方剂之一。方中盐黄柏[9]、牛膝[10]、薏苡仁[11]可抑制肾脏对尿酸的重吸收，促进肾脏排泄尿酸；苍术挥发油和去挥发油提取物能显著降低HUA小鼠的SUA水平[12]。研究提示，四妙丸可能具有多靶点的作用，除肾脏外还可能促进肠道尿酸排泄[13]。本研究以四妙丸干预HUA大鼠，旨在观察四妙丸对肠道总尿酸及十二指肠、空肠、回肠尿酸的影响，评价肠道排泄途径的降尿酸作用，为四妙丸在高尿酸血症中的临床用药提供实验基础，具有极大临床意义。本研究通过上海中医药大学动物福利与伦理委员会批准(编号PZSHUTCM191122001)。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级55只雄性SD大鼠，5～6周龄，体质量140～160 g，购于斯莱克实验动物有限责任公司，合格证SYXK(沪)2020-0009。饲养于上海中医药大学动物实验中心，大鼠分笼饲养，自由进食及饮水，室温维持26 ℃，湿度50%。

1.2 药物

四妙丸组成：苍术、盐黄柏、薏苡仁、牛膝，饮片由上海同济堂药业有限公司提供(批号200201、191201、191101、191202)；苯溴马隆片(宜昌东阳光长江药业股份有限公司，批号H20040348)；氧嗪酸钾(美国Sigma，批号H9733)；次黄嘌呤(美国Sigma，批号156124)；异氟烷(深圳瑞沃德生命科技有限公司，批号20082602)。

1.3 主要仪器

ADVIA2400全自动生化分析仪(德国西门子公司)；TDL-5000CR壹式大容量冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂)；PTHW5000 ML恒温电热套(郑州科泰实验设备有限公司)；旋转蒸发仪套(V-710 Vacuum Pump, R-200SE Rotavapor, F-114 Recirculating Chiller，瑞士BUCHI公司)；DZF-6210真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；HWS-24电热恒温水浴锅(上海一恒科学仪器有限公司)。

1.4 四妙丸浸膏粉制备

根据2020版《中华人民共和国药典》四妙丸组方，称取苍术(125 g)、盐黄柏(250 g)、薏苡仁(250 g)、牛膝(125 g)碾碎，加10倍量水浸泡30 min煎煮1 h，过滤收集药液，将残渣再次加8倍量水煎煮1 h收集药液。合并2次药液减压浓缩真空干燥，得浸膏261.62 g，浸膏提取率为34.88%。

1.5 动物分组、造模与给药

55只雄性SD大鼠适应性喂养后随机分为正常组10只，模型组、苯溴马隆组(4.7 mg/kg)、四妙丸高、中、低剂量组(2260.6 mg/kg、1130.3 mg/kg、565.2 mg/kg)每组各9只。除正常组外，造模大鼠以氧嗪酸钾(100 mg/kg，腹腔注射)联合次黄嘌呤(500 mg/kg，灌胃)每日1次，连续21 d，复制HUA模型大鼠。造模7 d后，SUA水平升高超过正常组20%以上则认为造模成功[14]。成模后模型组1只，四妙丸中剂量组2只，四妙丸低剂量组1只大鼠SUA水平未满足标准予以剔除，成功模型大鼠共计41只，成模率91.1%。验模成功后，正常组随机剔除2只，模型大鼠随机剔除1只并重新随机分配至各组，每组设置8只。第8天开始给予相应剂量药物灌胃干预，正常组和模型组给予等量溶媒，持续14 d。

1.6 样本采集和检测指标

1.6.1 血液样本 于实验过程中第7天(造模期)、第21天(干预期)给药后2 h，以眼眶取血采集血样，检测血清尿酸(serum uric acid, SUA)。

1.6.2 尿液样本 第21天用代谢笼收集24 h尿液，计算尿量后检测尿尿酸浓度。计算尿酸清除率(clearance of uric acid, CUA)(mL/h)=尿酸浓度×尿量/(24×血尿酸浓度)。

1.6.3 肠液样本 第21天以异氟烷呼吸麻醉安乐死大鼠后取材。十二指肠段从胃幽门向下取10 cm，回肠段从盲肠袋向上取5 cm，空肠段在空肠中部取20 cm。根据文献方法优化后采集肠液[15]，收集肠液时先用组织钳夹住肠段两端切断肠道，以10 mL生理盐水冲洗肠段，冲洗液即肠液样本。肠液样本38 ℃水浴1 h后检测尿酸浓度。十二指肠尿酸(duodenum uric acid, DUA)、空肠尿酸(jejunum uric acid, JUA)、回肠尿酸(ileum uric acid, IUA)(单位: μg/cm)=肠液样本尿酸浓度×样本体积/肠段长度；肠道总尿酸(total intestinal uric acid, TUA)(单位: μg/cm)=(DUA×10+JUA×20+IUA×5)/35。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 四妙丸对大鼠血液SUA的影响

造模期：与正常组比较，各组造模大鼠SUA显著升高(P<0.01)，造模成功。干预期：与模型组比较，苯溴马隆组、四妙丸各剂量组SUA水平显著下降(P<0.01)，提示苯溴马隆与四妙丸均能降低高尿酸血症大鼠血清尿酸水平(表1)。

表1 各组大鼠血清尿酸(Serum uric acid, SUA)水平比较

2.2 四妙丸对HUA大鼠尿液CUA的影响

模型组大鼠尿液CUA水平显著低于正常组(P<0.05)。与模型组比较，苯溴马隆组、四妙丸低剂量组尿液中CUA显著升高(P<0.01，P<0.05)，提示低剂量四妙丸可提高尿酸清除能力(表2)。

表2 大鼠尿液尿酸清除率(clearance of uric acid, CUA)比较

2.3 四妙丸对HUA大鼠肠道尿酸指标的影响

取大鼠肠液样本与正常组比较，HUA模型组大鼠肠道TUA水平无显著变化(P>0.05)，然而四妙丸低剂量干预动物肠道TUA水平显著增加(P<0.01)。与模型组比较，苯溴马隆组JUA无显著变化(P>0.05)，而四妙丸中剂量组、低剂量组JUA显著升高(P<0.05，P<0.01)，四妙丸低剂量组IUA显著升高(P<0.01)，提示四妙丸与苯溴马隆降低血液尿酸的途径并不相同，低剂量四妙丸能够促进肠内尿酸顺利排泄(表3)。

表3 各组大鼠肠道总尿酸(total intestinal uric acid, TUA)、十二指肠尿酸(duodenum uric acid, DUA)、空肠尿酸(jejunum uric acid, JUA)、回肠尿酸(Ileum uric acid, IUA)比较

3 讨论

中医认为高尿酸血症属于“膏浊病”“伏邪”等范畴，其发病与湿、热、痰、浊、瘀诸邪有关。国医大师朱良春更重视“浊瘀”，认为“浊瘀”是本病发生的重要病理因素[16]。“小肠受盛胃中水谷而分清浊”，小肠泌清别浊，将体内“浊瘀”之邪排出体外。“脾与小肠相通”，脾胃运化常影响小肠。若脾失健运则湿热内生，下注小肠，清浊不分，内生“浊瘀”不能排而致高尿酸血症。四妙丸以盐黄柏为君，取其寒以胜热、苦以燥湿，且善除下焦湿热；苍术、薏苡仁为臣，健脾燥利湿；牛膝为佐，引药直达下焦，逐瘀通经。四妙丸以清热祛湿为主，共治脾胃与下焦湿热。小肠归属下焦，四妙丸亦可清利小肠湿热。朱良春善用土茯苓加四妙丸配萆薢等药组方，重在泄化浊瘀、荡涤污垢，降低血尿酸[17]。其他学者亦以四妙丸加减化裁应用于高尿酸血症，收获良效[18]。

肾外肠道尿酸排泄减少是HUA的常见原因之一[5]。Yano[19]等发现，5/6肾脏切除术大鼠肾脏尿酸排泄减少，肠道尿酸增加，SUA水平并未升高。Sorensen[20]等发现，部分肾功能不全患者肠道是其尿酸排泄的主要途径。本研究以“浊瘀”和小肠“泌清别浊”为理论基础，探讨四妙丸对肠道尿酸排泄的影响，通过实验观察到造模期各组造模大鼠SUA水平显著高于正常组，且模型大鼠各组间SUA无显著差异，表明HUA模型成功复制，HUA基线水平一致。干预结束后，四妙丸高、中、低剂量组SUA水平均显著低于模型组，提示四妙丸可显著降低HUA大鼠的血尿酸，与文献报道一致[21]。其中，相较于苯溴马隆组，低剂量组SUA水平呈更低趋势，表明低剂量四妙丸的降尿酸作用优于苯溴马隆。模型组大鼠CUA水平显著低于正常组，提示HUA大鼠肾脏的尿酸清除能力较低，可能与HUA导致的肾脏受损有关[6]。苯溴马隆组、四妙丸低剂量组CUA显著高于模型组，表明四妙丸低剂量可增强肾脏清除尿酸的能力，促进尿酸排泄。苯溴马隆组、四妙丸低剂量组CUA无明显组间差异，但显著高于正常组，表明四妙丸低剂量与苯溴马隆组类似，具有较强的促进肾脏排泄尿酸的作用，可能与上调肾脏尿酸转运蛋白的表达有关[14,22]。通过各组大鼠肠道总尿酸比较发现，四妙丸各剂量呈一定量效关系，其中低剂量组TUA、JUA、IUA显著高于模型组和苯溴马隆组，提示低剂量四妙丸能促进大鼠肠道总尿酸的排泄；苯溴马隆组肠道总尿酸与模型组比较无显著差异，表明苯溴马隆作用靶点单一，无法促进肠道排泄尿酸。上述结果表明，四妙丸降低尿酸作用除肾脏途径外，还可通过促进肠道排泄尿酸，具有多靶点的优势。这可能也是低剂量四妙丸降尿酸作用优于苯溴马隆的原因。

进一步对肠道分段研究，各组大鼠十二指肠尿酸水平无显著差异，表明十二指肠的尿酸排泄情况受药物影响较小；通过比较空肠尿酸指标，四妙丸中、低剂量组显著高于模型组，表明四妙丸中、低剂量可促进空肠排泄尿酸；比较回肠尿酸，四妙丸低剂量组IUA显著高于模型组，表明低剂量四妙丸可有效促进回肠排泄尿酸。上述结果提示，四妙丸调控肠液尿酸排泄的主要部位在空肠、回肠，低剂量四妙丸促进不同肠段尿酸排泄的能力不同，回肠>空肠。Hosomi[23]等比较空肠、回肠、结肠对尿酸的清除能力，认为回肠>结肠>空肠与本研究结果类似。另一方面，以上实验结果显示，低剂量四妙丸促进肠道尿酸排泄作用优于高剂量四妙丸，改善高尿酸血症大鼠相关实验指标，这可能是由于高剂量四妙丸给药增加了动物代谢负担，影响其发挥正常促代谢、促排泄的作用，其中具体机制尚需后续实验探究与确认。

本研究以“浊瘀”病因病机和小肠泌清别浊功能为理论基础，探讨四妙丸对肠道尿酸排泄的影响，观察到四妙丸能有效调控肠道尿酸排泄，并猜想与调控基因表达有关，为促进肠道尿酸排泄治疗HUA提供了新的思路。