菌落总数测定纸片法用于食品微生物检验中的价值分析

谢展华

桂平市疾病预防控制中心 广西 贵港 537200

菌落总数是指食品经过处理﹑稀释及倾注平板后，维持在一定需氧情况﹑营养条件﹑PH值﹑培养温度及时间等情况下，1g被检样品所生长出来的细菌菌落总数[1]。而食品中菌落总数作为判定食品被细菌污染程度及卫生质量重要指标，反应食品生产﹑运输过程中是否符合卫生要求，且对被检测样品做出适当卫生评价[2]。因此，食品菌落总数严重超标时，表明其卫生状况达不到基本要求，而食品中营养成分遭受到破坏，加速食品腐败变质过程，食品会失去食用价值[3]。且消费者食用了微生物超标严重食品，会引起一系列消化道疾病，如细菌性肠胃炎，引起呕吐﹑腹泻﹑体温升高等症状，造成严重公共卫生事件。当前常规菌落总数检测作为常见措施，但操作复杂，检测准确性偏低及检测效率偏低等问题。当前纸片法作为一类快速检测技术，其应用效果显著，且快速，被广泛应用于食品检验中[4]。文章就纸片法应用于食品微生物检测中应用情况如下分析，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

选取2016年5月～2016年9月市场上随机购买饼干﹑糕点总计55份，55份饼干及糕点均为市场上随机购买，2份质控样品批号（编号：19-W799﹑19-J761，由中国检验检疫科学研究院测试评价中心提供）。平板计数琼脂培养基（plate count agar，PCA）（批号190703，有效期3年，北京陆桥技术有限公司）；3M Petrifilm 菌落总数测试片（货号 70200572157 明尼苏达矿业制造国际贸易有限公司提供）。

1.2 实验方法

平板计数法：培养基配置：培养基进行高压灭菌，将其放入恒水温的浴锅中，按照标准维持水温在46℃。样液制备：准备好的待测样品原液与质控样品10倍稀释并充分混匀后，制备成1:10的样品匀液。质控样品的制备：吸取4ml的生理盐水水化西林，彻底溶解后，及时移除溶液，并反复对容器内内壁清洗，回收的清洗液为质控样品。选择微量移液器对其进行吸取，9ml的稀释液并吸取1ml的样品匀液，混合制备成1:100分样品匀液。并采取平板计数法测定食品微生物菌落总数，检测过程中维持环境无菌性，主要步骤：选择1ml灭菌吸管吸取菌液稀释液，将其放置于平皿内，加入1ml无菌生理盐水并注入平板计数琼脂，将其摇匀后静置冷却﹑凝固，平板翻转，维持在36℃±1℃的温度下静置培养48h±2h。纸片法：制备培养基和样液，与平板计数法一致，制备培养基时，静置测试纸片，直至恢复常温，制备样液时与平板计数法相同，故不作赘述。纸片法对食品微生物菌落总数检测主要步骤：使用1ml灭菌吸管吸取菌液稀释液，放置于测试纸片上并覆盖，以同样条件对其进行培养。

计算方法：质控样品的测试结果采用“Z-比分数”评价, Z-比分数计算如下：Z=x -X/δ，x表示测试人员所提交的测试结果；X表示指定值；δ表示标准差。当|Z|≤2，测试结果满意；当 2<|Z|<3，测试结果有问题（可疑）；当|Z|≥3，测试结果不满意（离群）。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 平板计数法﹑试纸法对饼干﹑糕点平均菌落数对比情况

平板计数法﹑试纸法在饼干﹑糕点中平板平均菌落数无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 平板计数法、试纸法对饼干、糕点平均菌落数对比情况

2.2 两种方法检测结果中不同菌落数区间的比较分析

实验数据经统计学处理，饼干样品组﹑糕点样品组3种不同菌落数区间中，倾注法与纸片法检测菌落总数结果无显著差异（P＞0.05），见表2。

表2 两种方法检测结果中不同菌落数区间的比较分析

3 讨论

食品当被微生物污染往往为不可避免的。目前污染食品微生物主要为细菌。评价食品卫生质量状况多采取微生物检验中3项细菌指标，包括菌落总数﹑大肠菌落及致病菌，甚至对部分特定食品中存在着特定指标[5]。当前测定菌落总数其目的为了解食品生产中从原料加工到成品包装受到外界污染情况，经过上述方法可观察细菌在食品中繁殖动态，确定食品保存期，以便于对被检样品进行卫生学评价时提供合理依据。菌落总数是指被检样品中细菌和培养基混合后，每个细菌均形成一个可见的单独菌落的假定为基础[6]。检验过程中，处于有氧条件下培养，因而并不能测出每克或每ml中检样中实际的总活菌属。当前传统方式应用于菌落总数测定中有一定局限性。一方面，厌氧菌﹑微嗜氧菌和冷营菌在此条件下不生长，另一方面，对部分特殊营养要求的一些细菌均受到限制，所得出结果仅包括培养基中发育﹑嗜中温﹑需氧和兼性厌氧的细菌菌落总数，并不能代表样品中实际存在所有细菌总数。

目前，食品中菌落总数测定中，样品按照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》进行处理，平板计数法一般将样品制成几个不同的10倍递增稀释液，后从每个稀释液中分别取出1ml置于无菌平皿中与营养琼脂培养基混合，当处于一定温度﹑一定时间后，通过对每个平皿中形成菌落数量加以依据，并依据稀释倍数计算出1g原始样品中所含有细菌菌落总数[7]。但上述操作方式中，操作复杂性较高，且前期准备﹑后期清洗消毒工作量大，当处于检测任务大﹑检测批次较多情况时，极易出现交叉污染，降低检测结果准确度，且检测效率偏低。伴随着近些年来我国生物技术不断发展，多种即用型菌落总数测试培养基不断开发，可有效对前期工作准备简化，且后期清洗消毒工作相对减少，目前被广泛用于食品检测领域中[8]。纸片法优点为开展食品微生物菌落总数检测过程中减少培养基配置﹑琼脂的高压灭菌等繁琐步骤，极大程度节省了人力物力，检测同样数量样品过程中，纸片法主要是应用薄纸片，平板计数法一个稀释梯度则需要2个平行，检测一个样品菌落总数则需要多个梯度，需要用到多个平板，样品较多时，则培养平板所占据体积较大，多数检测机构因场地受限制，不便购买更多培养箱满足检测需求。纸片法则适用于培养场地小﹑检测样品数量多的检测机构[9]。本文研究指出，通过在市场上随机购买75份食物样品饼干﹑蛋糕，并分别采取平板计数法﹑纸片法测定食品中微生物菌落总数，对测得结果分析得出，试纸法饼干﹑糕点对平板平均菌落数测定上无统计学意义，（P＞0.05）。对两种方法检测结果中不同菌落数区间的比较分析，实验数据经统计学处理，饼干样品组﹑糕点样品组3种不同菌落数区间中，倾注法与纸片法检测菌落总数结果无显著差异（P＞0.05）。表明上述两种检测方法最终检测结果基本无差异性。同时，通过对质控样品检测结果进行统计，平板计数法与纸片法均适用于食品菌落总数的测定。当前对平板计数法与纸片法检测食品微生物菌落总数研究结果得出，纸片法适用于场地小﹑监测数量较多情况，且最终结果与平板计数法相同，并获得较好检测效果[10]。鉴于目前国内食品微生物检验中采取GB4789.2-2016标准为强制性标准，纸片法检测食品菌落总数可适用于监控食品微生物污染，并作为产品质量监督。但食品菌落总数检测结果在该产品判定标准规定限度附近﹑涉及仲裁检测，应当选择平板计数法报告检测结果。

综上所述，菌落总数测试试片法应用于食品菌落总数中可快速检测，能缩短检测流程，整体工作效率偏高，值得应用。