Leica ST5020全自动组织切片染色机苏木精-伊红染色程序设置的体会

汪洁，黄宇翔，苏丽清，伊雪*，石莺

（1.厦门医学院基础医学部，福建 厦门 361023；2.厦门医学院机能与临床转化福建省高校重点实验室，福建 厦门 361023）

苏木精-伊红染色法（hematoxylin-eosin staining），简称HE染色法，是石蜡切片技术的常用染色法之一。苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核酸着紫蓝色；伊红为酸性染料，可使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。将组织切片放入染料后，经一定时间，使组织细胞或其他成分染上不同的颜色，产生不同的折射率，最后于光学显微镜下进行观察和研究。HE染色法是组织学、胚胎学、病理学教学与科研中最基本、使用最广泛的技术方法之一。

随着科学的不断发展，微电子技术和计算机技术的不断进步，程序控制的全自动式组织切片染色机应运而生。染色机可完成模拟手工操作的方法，可连续进行染色、自动记忆，具有可重复性、稳定性，染色效果好、质量控制佳等优点[1]。同时，其可取代手工操作中繁杂且对人体有害的环节，显著降低劳动力及时间成本，提高工作效率，满足广大病理技术工作者的要求，对病理科及现代化实验室的推进具有重要意义[2]。本校组织病理实验室于2015年采购了Leica ST5020全自动染色机，经过一段时间对程序设置的研究学习，体会如下。

1 材料与方法

1.1 材料 选取2019年5月至2020年5月厦门医学院附属第二医院胸心外科及厦门医学院呼吸疾病研究所送检的各类活检组织标本400例。

1.2 仪器 Leica ASP20S全自动脱水机、Leica EG1150H+EG1150C组织包埋机（含冷台）、Leica RM2235石蜡切片机、Leica HI1210摊片机、Leica HI1220烤片机、Leica ST5010全自动染色机。

1.3 试剂 改良Lillie-Mayer苏木精液，1%醇溶伊红，1%水溶伊红、1%盐酸酒精、0.5%盐酸酒精、4%乙酸、饱和碳酸锂水溶液、二甲苯及梯度酒精。

1.4 Leica ST5020全自动染色机程序设置 Leica ST5020全自动染色机程序的具体设置，见表1。

表1 Leica ST5020全自动染色机程序设置

2 结果

2.1 苏木精染色前经乙酸酸化的结果分析 切片进入苏木精液前先经4%乙酸15 min后，镜下显示胞核呈蓝色，核内染色质颗粒细腻，核仁、核膜清晰，红蓝对比良好，透明度高，见图1。

图1 苏木精染色前经乙酸酸化的结果分析（×400）

2.2 盐酸酒精分化液不同浓度及处理方式比较如将分化时间精确为1 s，仍出现分化过度的情况（图2A），可将盐酸酒精的浓度从1%降至0.5%。镜下见染色核质分明，色彩鲜艳（图2B）。如盐酸酒精的浓度不变，将分化后的切片重新进入改良Lillie-Mayer苏木精液中染2 min后水洗返蓝，发现细胞质中吸附过多的染料，间质中也出现不应着色的区域，背景偏灰，透明度不高（图2C）。

图2 盐酸酒精分化液不同浓度及处理方式比较（×200）

3 讨论

3.1 HE染色前烤片 一般在65℃的温箱内烤片30～60 min。温度过高，会引起切片细胞收缩；时间＜20 min，易造成脱片[3-4]。

3.2 二甲苯脱蜡 脱蜡要彻底，时间的设置需根据环境中温度、湿度、切片温度、二甲苯使用时间及脱蜡片数决定，时间宁长勿短。脱蜡彻底的切片呈透明状，若呈云雾状说明脱蜡不彻底[2]。脱蜡不干净将影响染色，造成切片染色不均的现象。

3.3 梯度酒精脱二甲苯 切片用二甲苯脱蜡后，不能直接水洗，因二甲苯不溶于水，需经酒精进行溶解，酒精可溶解二甲苯，又能与水混合。组织脱蜡后经由高至低的梯度浓度酒精处理后可进行水洗并与水溶性的染色剂结合。

3.4 染色前组织切片酸化 参照陈世梁等[5]研究，将切片进入苏木精染液前先经4%乙酸酸化15 min。一方面酸化的组织切片，可增加细胞核的选择性染色，使细胞核染色质显示更加清晰细致，从而提高染色质量。另一方面可稳定苏木精染液的pH值，防止氧化膜形成，延长染液的使用寿命。镜下见细胞核呈蓝色，核内染色质颗粒细腻，核仁、核膜清晰，红蓝对比良好，透明度高。因此，将该步骤设置在常规程序中。

3.5 分化液浓度的选择及时间的设置 HE染色盐酸酒精分化至关重要，手工染色分化程序需镜下控制，一般为1～3 s。由于机械手起落需耗时间，不像手工染色时快速水洗，即使精确设置为1 s，还会出现分化过度的情况。查阅相关资料[6]，按照两种方法进行设置，一是将盐酸酒精的浓度从1%降至0.5%，达到较好的分化效果。二是盐酸酒精的浓度不变，将分化后的切片重新浸入Harris苏木精液中染色2 min后水洗，再浸入饱和碳酸锂水溶液返蓝，染色对比度、透明度较降低分化液浓度效果差。染色结束后，需将盐酸酒精分化液倒入棕色瓶内，以免长期放在机器内，腐蚀电子元件[2]。

3.6 返蓝液的选择 返蓝液为弱碱性自来水或返蓝液。目的是中止盐酸酒精分化，使在酸性环境下呈红褐色的切片多为蓝色。可用自来水冲洗，也可用0.5%氨水或饱和碳酸锂水溶液等，均可达到返蓝的目的。

3.7 伊红染液 可选醇溶，也可选择水溶。如选择1%醇溶伊红，设置程序时醇溶性伊红使用过程中，为减少过多的水分带入伊红影响染色效果，可先浸入70%乙醇溶液约1 s，再染伊红，后入水洗去浮色。而采用水溶性伊红染色则无需该步骤。切片在70%乙醇中的时间要短，因70%乙醇与1%盐酸酒精中酒精浓度一致，对切片具有一定分化作用，且低度酒精对伊红有分色及褪色作用，因此，时间一般设置在数秒内。

3.8 脱水、透明剂的选择 染色后组织经从低到高的浓度酒精处理，去除组织中残留的水分，为二甲苯透明组织创造条件，使组织切片的透明度达到光镜观察时的要求。最后一缸无水乙醇纯度要高，防止将水带入二甲苯；最后一缸二甲苯纯度同样要高，以便将无水乙醇彻底脱净。如环境中湿度高、使用时间长、处理的切片多，需及时更换无水乙醇跟二甲苯。

3.9 试剂位置的放置 程序设置时需将水洗的步骤靠近水槽输出口，可防止机械手提起染色架时染液滴入其他试剂中。分化、返蓝试剂也应放置在水槽边，以缩短机械手在空中停留的时间。

3.10 时间设置 多个程序同时运行时应设置好时间，避免程序冲突。脱蜡、透明所用的二甲苯和脱二甲苯、脱水的无水乙醇可采用部分更新的方法，即第一缸试剂倒入废液桶，后面的试剂前移，最后一缸倒入新液。

自动染色机的程序设置与多种因素相关，不同品牌的染色机程序设置不同，同一型号的染色机程序设置上也存在差异。为达到更好的染色效果，需实验技术人员在实际操作过程中进行不断探索研究。