Hp阳性胃溃疡患者Hp根除前后的肠道菌群特征研究

鲁艳妮，周清文

长安医院消化内科，陕西 西安 710016

胃幽门螺旋杆菌(H. pylori，Hp)属于革兰氏阴性菌，耐酸属性使其成为胃内优势菌种，定植于胃黏膜上皮，分泌多种毒素，引起胃部损伤[1]。据统计，全球约超过50%的人感染Hp，国内有19 个省市人群HP感染率超过50%[2-3]。Hp 引起的胃溃疡无法自愈，严重者会引起胃出血，甚至发生胃癌，因此Hp的根除治疗在胃肠疾病中至关重要[3]。人体肠道内有10万亿个细菌与人类共生，它们可以利用蛋白质残渣合成人体必需氨基酸，参与糖脂代谢，在控制体重、提高消化能力、抵御感染、促进微量元素吸收等方面有着重要作用[4]。人体肠道内微生物之间互相制约，相互依存，在人体内形成一种复杂的生态平衡[5]。有研究表明在根除Hp 治疗过程中，会改变口腔及胃肠道菌群组成，并提高耐药菌定植于肠道的概率，患者肠道微生态受到长时间影响后可能需要4 年时间才能恢复到正常水平[6]。目前关于Hp 阳性染胃溃疡患者肠道菌群分布特征报道较少。本研究通过检测Hp 阳性胃溃疡患者肠道菌群分布，进一步阐述患者治疗前后肠道微生态环境的变化，为临床Hp感染胃溃疡治疗奠定基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018 年4 月至2020 年3 月长安医院收治的122 例Hp 阳性胃溃疡患者为研究对象。纳入标准：①胃镜检查显示明显溃疡病灶伴随黏膜水肿及皱襞不集中，符合《胃肠道疾病内镜诊断与治疗学》[7]中胃溃疡诊断标准；②符合《第五次全国幽门螺杆菌感染处理共识报告》[8]，通过胃黏膜活检后组织切片染色及14C 尿素呼气试验判断Hp 阳性；③患者免疫系统正常，可以耐受Hp 根除治疗；④1 个月内未服用抗生素、质子泵抑制剂(PPI)、益生菌等影响肠道微生物分布的药物者。排除标准：①既往抗生素药物过敏者；②合并患有其他胃肠功能疾病，需要进行胃部手术者；③严重内部感染，寄生虫感染者；④肝肾功能不全者；⑤妊娠及哺乳期妇女；⑥无法完成治疗后随访者。122 例患者中男性58 例，女性64 例；年龄48～60 岁，平均(48.63±12.24)岁。本研究经我院伦理委员会审核通过，患者均知情并签署知情同意书。

1.2 胃镜检查及胃黏膜取样 患者提前禁食12 h，检查前喉咙部局部麻醉，选取左卧位，患者检查过程中检查过程中保持深呼吸，切勿咬胃管。通过活检钳钳取5 块胃黏膜组织用于切片检查，分别取自如下位置：2 块来自胃窦，2 块来自胃体，1 块取于胃角。所有取样标记部位后液氮冻存，用于Hp阳性检查。

1.3 HP 治疗方法 参照《消化内科疾病诊疗指南》[9]给予质子泵抑制剂、胃黏膜保护剂等常规治疗，并进行含铋四联疗法(艾司奥美拉唑镁肠溶片20 mg(江苏济川药业有限公司)，1粒/次，2次/d，早晚餐前半小时口服；胶体果胶铋胶囊200 mg(浙江得恩德制药有限公司)，1 粒/次，3次/d；阿莫西林胶囊1000 mg(深圳高卓药业有限公司)，1粒/次，2次/d，早晚餐后口服；克拉霉素缓释胶囊500 mg(江苏恒瑞医药股份有限公司)，2次/d，早晚餐后口服。14 d为一个疗程，治疗Hp感染胃溃疡，及时记录患者在治疗过程中的不良反应。治疗结束及结束后4周胃黏膜切片病理学检查显示阴性并且14C 尿素呼气试验结果＜100(dmp/mmol)，即判定Hp根除。

1.4 胃溃疡愈合判断 治疗前后取患者胃黏膜判定溃疡病理分期[7]：胃溃疡疾病进程主要分为A 期(溃疡活动期)、H 期(黏膜愈合期)和S 期(溃疡瘢痕期)。A 期分为A1期和A2期，A1期主要表现黏膜高度水肿，底部有黄色和白色的浓苔；A2期溃疡有愈合趋势，溃疡的周围出现红晕，黄白苔开始减少。H期分为H1期和H2期，H1期黏膜开始愈合，溃疡缩小，再生上皮形成的红晕向溃疡面聚集；H2期，黏膜愈合期的再生上皮将溃疡的底部被再生上皮完全覆盖，溃疡已经到达愈合期。S 期分为S1期和S2期，S1期主要是指的是溃疡愈合后形成红色的瘢痕；S2期指红色瘢痕消退，变成白色瘢痕期，溃疡完全愈合。胃镜结果显示溃疡处于H1～S2期，即判定溃疡愈合。

1.5 粪便检查及肠道微生物DNA 提取 于Hp根除前1 d、治疗结束后1 d、治疗结束后4 周分别采集患者新鲜粪便10 g 混合于0.9%生理盐水10 mL，1200 r/min 5 min离心3次，去除粗颗粒，收集上清后，9000 r/min 离心3 min，取沉淀悬浮于缓冲液中，用于微生物DNA提取。取200 μL 菌体样品，加入1 mL 抑制剂，涡旋混合后70℃加热，12000 r/min 离心3 min取上清，加入蛋白酶K，整个操作过程按照QIAamp DNA Stool Mini Kit 试剂盒(德国QIAGEN 公司)说明书，提取样本细菌基因组并检测DNA含量。

1.6 肠道菌群鉴定与分布 进行聚合酶链式反应(PCR)后，进行琼脂糖凝胶电泳分析PCR条带，根据是否存在非特异性扩增判断不同菌群引物特异性好坏，以用于后续荧光定量PCR(RT-qPCR)扩增。遵照RT-qPCR试剂盒(北京天根生物有限公司)说明进行操作，根据公式copies/μL=(6.02×1014×质粒浓度ng/μL)/(质粒分子量×660)计算标准品质粒拷贝数，将质粒标准品连续稀释10 倍，分别以101～109为质粒模板进行RT-qPCR，构建标准曲线。反应体系：SYBR Premix Ex Taq 10 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，DNA5 μL，ddH2O 3 μL。反应条件：95℃8 min；95 ℃变性10 s，58℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，重复50 个循环。待测样本微生物DNA反应体系与反应条件与上述相同，根据标准曲线计算每个样本拷贝数，上下游引物序列见表1。

表1 引物序列

1.7 统计学方法 采用SPSS24.0 统计学软件分析数据。符合正态分布的计量资料均以均数±标准差(-x±s)描述，两两样本比较采用独立样本t检验；非正态分布数据以四分位数间距M(P25，P75)表示，组间比较采用Mann-Whitney U 检验，组内两两比较采用Z 检验；计数资料比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Hp根除及溃疡愈合情况 根据Hp感染和根除诊断标准，治疗结束后共112 例显示Hp 阴性，10 例显示Hp阳性，根除率达91.80%。胃镜结果显示，治疗前A1期105 例，A2期17 例；治疗后符合胃溃疡愈合判断标准的共117 例，分别为：H1期18 例，H2期32 例，S1期59 例，S2期8 例，溃疡愈合率达95.90%；治疗后未达愈合标准的共5 例，均为A2期。治疗过程中6 例患者出现轻度腹泻及恶心，均可耐受并自行缓解。

2.2 Hp 根除前后胃溃疡患者肠道菌群特征 与治疗前比较，治疗结束时大肠埃希菌属、粪肠球菌数量均升高，长双歧杆菌、脆弱拟杆菌数量均降低，差异均具有统计学意义(P＜0.05)，嗜酸乳酸菌数量无明显变化，差异无统计学意义(P＞0.05)；治疗结束后4 周各菌群数量无明显变化，差异无统计学意义(P＞0.05)。与治疗结束时比较，治疗结束后4周大肠埃希菌、粪肠球菌数量均降低，长双歧杆菌、脆弱拟杆菌数量均升高，差异均有统计学意义(P＜0.05)，嗜酸乳酸菌数量无明显变化，差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2和图1。

表2 Hp阳性胃溃疡患者Hp根除前后肠道菌群特征(log copies/g，n=112)

图1 Hp阳性胃溃疡患者Hp根除前后肠道菌群比较

3 讨论

研究表明，Hp是胃溃疡患者的主要致病因素，Hp不仅损伤胃黏膜，还会促进胃酸分泌，进一步加重胃溃疡[10]。人体肠道微生态环境与人类健康息息相关，在免疫调节、促进发育、抵抗病原侵袭等方面发挥重要作用[11]。有研究报道双歧杆菌、乳酸杆菌等可以合成人体生长发育必须的B族维生素、烟酸等[12]。此外，肠道菌群可以利用宿主体内营养物质合成神经递质、氨基酸等化合物，对机体发出调节信号[13]。研究表明肠道菌群参与多种胃肠疾病的发生发展，如萎缩性胃炎、抵抗性腹泻、结肠癌等，在机体消化系统疾病中起重要作用[14]。

治疗后112 例显示Hp 阴性，根除率达91.80%；胃溃疡愈合117例，溃疡愈合率达95.90%，溃疡愈合分期如下：H1期18例，H2期32例，S1期59例，S2期8例，治疗过程中出现的轻度不良反应包括腹泻及恶心，均可自行缓解。提示四联法治疗可以有效安全地根除Hp，并帮助患者愈合溃疡伤口。目前在根除Hp 治疗方案中，质子泵抑制剂(PPI)和铋剂联合两种抗生素为首选治疗方法，铋剂协同PPI减少胃酸分泌，防止溃疡面进一步扩大，抗生素抑菌消炎促进伤口愈合[15]。治疗结束时大肠埃希菌属、粪肠球菌数量均比治疗前升高，长双歧杆菌、脆弱拟杆菌数量比治疗前降低，嗜酸乳酸菌数量无明显变化；治疗结束后4周大肠埃希菌、粪肠球菌数量均比治疗结束时降低，长双歧杆菌、脆弱拟杆菌数量均比治疗结束时升高，嗜酸乳酸菌数量无明显变化；治疗结束后4 周各菌群数量相比治疗前无明显变化。提示Hp 根除治疗后对肠道菌群多样性产生影响，引起肠道微生态环境失衡，停药4周后肠道菌群分布开始恢复。研究表明，在Hp 根除治疗过程中，患者常出现恶心，腹泻等胃肠功能失调症状，PPI在减少胃酸分泌的同时会影响胃酸抑制细菌的能力，导致外来细菌更易侵入机体，从而改变肠道微生态环境[16]。有研究报道，抗生素药物的使用会影响有益菌的定植和生长，引起细菌耐药性，改变肠道优势菌群种类和数量，导致肠道微生态发生变化，引起患者胃肠功能紊乱[17-18]。本研究结果显示治疗后Hp 根除率较高，但治疗结束后肠道菌群数量发生变化，肠道微生物定植力受到一定影响，治疗结束后4 周肠道菌群有一定恢复趋势。

综上所述，本研究通过检测治疗前后肠道菌群分布反映Hp 阳性胃溃疡患者肠道微生态变化，为临床治疗Hp感染胃溃疡提供更多思路。