AI技术在乳腺原位癌Ki67染色切片定量检测中的应用价值

沈苗 嵇学仙 谢红芳 姚根新 毛建英 潘建强 陈国群

我国乳腺癌的发病率占女性肿瘤的第1位，严重危害女性的身心健康［1］。Ki67是预测乳腺癌患者预后较为重要且可靠的标志物，Ki67高比例表达是预后的不良因素［2］。目前，我国大多数医院的病理科医师仍以显微镜目测评价Ki67指数，人为主观性大。有效提高乳腺原位癌Ki67定量检测的准确性是研究者的共同目标。本文探讨人工智能（AI）技术在乳腺原位癌Ki67染色切片定量检测中的应用价值。

1 资料与方法

1.1 临床资料 回顾分析2013年1 月至2021年1月本院乳腺原位癌样本110例，年龄36～84岁，平均年龄（52±4.5）岁。其中乳腺导管原位癌92例，占比83.6%（见图1、2），乳腺导管内乳头状癌11例，占比10%（见图3、4），乳腺实性乳头状癌7例，占比6.4%（见图5、6）。所有Ki67免疫组化由有资质的病理专业医师作出判读后再进行AI检测。

图1 乳腺导管原位癌（HE×100倍）

图2 乳腺导管原位癌（Ki67×100倍）

图3 乳腺导管内乳头状癌（HE×100倍）

图4 乳腺导管内乳头状癌（Ki67×100倍）

图5 乳腺实性乳头状癌（HE×100倍）

图6 乳腺实性乳头状癌（Ki67×100倍）

1.2 方法 （1）组织标本的制备：选择乳腺导管原位癌的蜡块制备成 3μm 厚的切片免疫组化染色。免疫组化染色试剂盒和Ki67单克隆抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；二氨基联苯胺（DAB）显色试剂盒，购自福建迈新生物技术有限公司。（2）免疫组化检测［3］：乳腺原位癌标本免疫组化采用 En Vision二步法检测 Ki67 蛋白的表达情况，以TBS代替一抗作阴性对照，以试剂盒阳性片作阳性对照。选取经苏木精－伊红（HE）染色验证的乳腺原位癌组织石蜡块，切出石蜡3μm，将其放到载玻片上，以60℃烤片4 h；2次二甲苯脱蜡，乙醇梯度脱水后进行水洗；修复抗原，蒸馏水冲洗，5 min×3次；3% H2O2溶液处理15 min，PBS冲洗，5 min×3次；一抗4 ℃孵育12 h，PBS冲洗，5 min×3次；二抗25℃孵育30 min，PBS冲洗，5 min×3 次；DAB室温下3～5 min显色，苏木素复染1～2 min细胞核，以梯度乙醇脱水，以二甲苯透明，以中性树胶进行封片，在镜下观察。每张切片由2位病理专家独立阅片共同协商出判断结果。

1.3 判断标准 （1）Ki67阳性判定标准：Ki67 蛋白阳性染色定位于细胞核，颗粒呈棕黄色。每张切片观察5个具有代表性的视野（×400），每个视野计数100个细胞，计算Ki67阳性细胞数占细胞总数的比例［4］。参考NCCN指南及多项研究报道，包括浸润性和非浸润性乳腺癌，选择14%作为Ki67表达的临界值，将乳腺原位癌病例分为Ki67比表达组（≤14%）和高表达组（＞14%）［5～6］。

1.4 AI检测 （1）AI和图像定量分析相结合对乳腺原位癌Ki67切片的扫描分析。AI系统采用浙江赛尔微因公司生产的数字化智能细胞组织病理图像分析软件。制作的免疫组化Ki67片使用宁波江丰公司的数字图片扫描技术。整个过程采用产品说明书操作。（2）110例乳腺原位癌Ki67病例，用该软件的乳腺原位癌Ki67切片扫描成像并圈出癌症区域。扫描10个热点区域得出的平均数值后得出结果。然后将这些数字图像汇集，存入数据库中。软件在后期分析图像时，会使用数据库中的图像数据。若软件在分析时，出现癌症区域漏圈或错圈，则由医师进行标注漏圈和错圈部分，再存入数据库中进行训练，以此达到完善数据的目的。

1.5 统计学方法 采用SPSS25.0统计学软件。计数资料用%表示，用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 110例乳腺原位癌Ki67样本检测结果 见表1。

表1 110例乳腺原位癌Ki67样本检测结果

表1 （续）

2.2 Ki67＞14%与Ki67≤14%的 检 测 结 果 比较 Ki67＞14% AI阅片与人工阅片阳性比例差异有统计学意义（P＜0.05），AI阅片有更高的敏感性。Ki67≤14% AI阅片和人工阅片阳性比例差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1、2。

图1 Ki67＞14%的检测结果比较

2.3 阅片时间 Ki67人工阅片每例平均时间12.7 min。AI阅片每例平均时间10.9 min，二者比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 Ki67≤14%检测结果比较

3 讨论

乳腺癌是一种极具异质性的疾病，即使同种分子分型的乳腺癌也有完全不同的预后。乳腺癌相同的期别也具有不同的生物学特性［7-8］。乳腺原位癌是乳腺癌的早期病变。通过手术切除，经正规药物治疗等综合治疗，效果确切，可达到痊愈目的，且较少出现复发和转移。乳腺原位癌如果不进行治疗，进一步可发展为乳腺浸润性癌，其治疗以手术，放化疗，靶向治疗为主，预后及患者生存时间较差。

针对预后靶点的治疗与防治能够显著提升患者预后及治疗效果。已有研究显示，Ki67作为乳腺癌病理诊断的分子标志物，是敏感度较好的独立指标［9］。DE等［10］Meta分析显示，Ki67阳性表达的肿瘤细胞恶性程度高，增殖活跃，肿瘤生长速度快，侵袭及转移率高，预后差。近年来，AI技术应用于病理图像分析日益成熟［11］。有文献提示AI阅片检测结合人工阅片后提高筛查的敏感性同时保证特异性并明显提高工作效率［12］。本资料结果显示，Ki67＞14% 43例：AI阅片和人工阅片阳性比例差异有统计学意义（P＜0.05）。AI阅片有更高的敏感性。Ki67≤14% 67例：AI阅片和人工阅片阳性比例差异无统计学意义（P＞0.05）。AI独立使用于乳腺原位癌Ki67的筛查尚不成熟。

借用AI的识别和深度学习能力，帮助医师审片更加精准高效。AI在病灶区域识别速度上胜于人工操作，同时也有利于对Ki67的定量检测进行量化，使得检测结果更加精准，为后续对乳腺原位癌的治疗方案提供客观的病理诊断依据。有利于临床医师制定针对性的治疗方案。

因此，乳腺癌原位癌Ki67染色切片定量检测中的热点确定对实现大数据进而实现人工智能有着深远意义。随着计算机技术的进步及更大数据库的建立使用，AI技术将有更广阔的应用前景。