MPTP 致帕金森病动物模型的研究进展*

吕海燕 侯广玉 朱 梅

(牡丹江医学院基础医学院，牡丹江 157011)

帕金森病 (Parkinson’s disease, PD) 是常见于中老年人群的神经退行性疾病，患病率随年龄增加逐步增高[1]，大约有1% 的 60岁以上的人受到 PD 的影响，80 岁以上人群患病率约为3%[2-3]，相关研究[4]数据显示，我国 PD 患者高达1.7%，PD 其他相关疾病的发病率也随着年龄的增长而增加。PD 主要病因是黑质-纹状体内以多巴胺(dopamine, DA)合成减少，神经生化发生改变，多巴胺能神经元变性坏死会导致脑内多巴胺含量显著减少。目前没有有效方法治愈 PD 病变，为更好地研究其发病机制及临床治疗，制备实验模型成为必不可少的研究手段。神经毒素在动物模型中诱导 PD 的特定临床特征，如1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine,MPTP)、6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine,6-OHDA)、百草枯和鱼藤酮[5]。PD 模型各有优点和不足，不同造模方法、给药方式及剂量都会影响实验模型的作用机制与实验结果。本文主要针对 MPTP 诱导的 PD 动物模型进行阐述。

1 帕金森病的动物模型

PD病理生理机制复杂，动物模型不能完全模拟出全部的病理和疾病症状。目前PD 动物模型主要为三类：神经毒素模型(如：MPTP、6-OHDA、鱼藤酮、百草枯等)、转基因模型(如：parkin、PINK1 和 DJ-1) 及以上二者联用模型。PD模型在一定程度上再现了其主要病理生理特征，包括黑质致密部(substantia nigra compacta，SNc) DA能神经元进行性丢失、路易小体 (Lewy body，LB)形成和运动缺陷等[6]。6-OHDA模型可单双侧造模，但不能透过血-脑屏障，一般适用于药理学筛选药物。鱼藤酮模型中毒素直接进入 DA 能神经元，高剂量造模会导致毒性作用大、副作用大、后遗症多，主要用于研究 DA 能通路中的氧化应激和神经炎性反应[7]。百草枯模型符合环境因素诱发的 PD 研究，虽然PD模型行为学改变更显著，但是模型制备成功率较低。遗传基因动物模型的制备时间长、过程复杂、副作用多，从研究 PD的病理变化以及从基因分子水平为PD发病机制提供研究基础。MPTP模型呈现 PD 急性或亚急性过程，可造成 DA 能神经元损伤或坏死而导致PD的部分临床症状发生，经小剂量持续MPTP给药制备的慢性动物模型不仅出现急性模型的PD病理改变，还能观察到 α-突触核蛋白的聚集，甚至有研究发现了LB 样包涵体[8]。

2 MPTP的发现及毒性作用机制

MPTP是一种人工化学合成的中间产物，具有海洛因样作用，美国国家心理健康研究所最早发现它的神经毒性和其他哌替啶衍生物[9]。1983 年美国加州少数披头士服用了被 MPTP 污染的毒品后，出现了类似 PD 的临床症状，继而发展成为不可逆的亚急性帕金森综合征[10]。

MPTP 作为一种镇痛剂的脱羧杂质，是一种本身没有毒性的脂溶性有机化合物，非常容易通过血-脑屏障。MPTP 选择性地经星形胶质细胞线粒体外膜的单胺氧化酶-B (monoamine oxidase-B, MAO-B) 催化为中间代谢产物1-甲基-4苯基-2，3-二氢呲啶离子 (MP-DP+) ，然后该中间体再经过进一步自发氧化生成有毒代谢物 MPP+[11]。因化学结构与 DA 相似，MPP+可与多巴胺能转运体 (dopamine transporter, DAT) 高度亲和[12-13]。活性形式 MPP+通过 DAT 进入多巴胺能神经元后加速积聚，随着浓度梯度积累，该物质能够抑制线粒体复合物 I活性，干扰并阻断线粒体电子传递链，最终导致 ATP 的消耗，氧自由基生成增加，细胞内一氧化氮 (NO) 含量增加，从而导致 DA 能神经元变性和死亡[14-16]。MPTP 动物模型因其在线粒体中具有独特的拮抗活性而被推荐用于研究 PD 线粒体功能障碍。

3 MPTP 诱导的 PD 动物模型

PD 动物模型使用的动物种类广泛多样，可大致分为四类，包括啮齿类、灵长类、哺乳动物(小型猪、狗、猫)和其他动物(果蝇、斑马鱼)。其中，啮齿类动物最常用于神经毒素模型中细胞和分子水平上的机制研究[17]。用药量和方法不同均对 MPTP 模型的造模结果有较大影响[18]，MPTP 可以通过腹膜内、皮下、静脉内给药，模拟其他肌肉注射的功能障碍以及产生双侧损伤的能力，双侧病变对于人类疾病影响在有限的适当区域特别有用[19-20]。在注射毒素后，行为测试中可以看到运动障碍，但在急性中不易察觉[21]。

3.1 MPTP 猴模型

在研究神经系统疾病的过程中，非人类灵长动物 (non-human primates NHP) 模型在对疾病机制方面研究起关键作用，因为 NHP 与人类的遗传和生理密切相关[22]，人与猴基因组相似度95%，NHPs中的MPTP模型症状、病理生化指标及神经病理学方面的改变与人类 PD 临床表现相似并且症状稳定，对 PD 治疗药物的反应也与人类相似[23]，广泛用于测试抗 PD 药物和潜在的疾病改善干预措施[24]，例如，猕猴的 SNc 中多巴胺能神经元显著损失，并诱导出 PD 的主要轴向运动和姿势的异常[25]，表现出类似人类舞蹈肌张力障碍的左旋多巴引起的运动障碍[6]。

MPTP 毒性作用存在种属差异，不同给药方式和给药时间会表现出不同的病理特征。如食蟹猴和恒河猴同属于猕猴，但是食蟹猴对 MPTP 的敏感性更强[26]。MPTP 暴露引起的神经毒性很快，不能模拟 PD 慢性发生的过程[26]。在此基础上建立了一个稳定的慢性 NHP 帕金森模型[27]，一周两次肌肉注射小剂量给药(0.2 mg/kg)。采用慢性 MPTP 给药方案[28](肌肉注射0.2～0.5 mg/kg，1 次/周，持续21 周)，模型中重现 PD 患者大脑中多巴胺能神经元退变过程。连续3 d对狨猴进行皮下注射给药，第0、1和2天的剂量分别为2、2和1 mg/kg，MPTP总积累剂量为5 mg/kg，模型猴的左右两侧大脑损伤程度不一致，行为学特征持续了1年以上[29]。老年猴通常比青年猴更易感[30]，5～9 岁恒河猴所需要的MPTP 剂量是20～23 岁恒河猴的3倍[31]。有研究[32]发现老年恒河猴肌肉注射制备模型时模型猴病情变化不可控，采用肌注+静脉注射给予 MPTP 的青年恒河猴呈现了稳定的运动和非运动症状[33]。

灵长类动物在 PD 研究中使用较早，MPTP 猴模型获得了与 PD 神经退行性变、线粒体功能障碍和氧化应激相关的重要信息，但是非人灵长类动物模型优缺点明显[34]。虽然该类动物与人类进化亲缘性最高，实验结果最为接近，但该类动物在每次实验中使用数量较少，饲养、操作复杂，成本较高，且使用数量局限。

3.2 MPTP 鼠模型

受经济、伦理道德等的原因限制，只有少数的实验室能够使用灵长类模型[35]，与灵长类动物相比较，啮齿类动物价格更便宜、更易于控制，又因大鼠对 MPTP 毒性具有较强抵抗性[36]，所以 MPTP 小鼠模型成了最普遍应用的 PD 动物模型[37]，其中最敏感的小鼠系是C57BL/6 品系的小鼠，己被广泛用于研究 PD 的发病机制、诊断和治疗[38-41]。

根据不同的间隔时间、注射剂量、方式以及时间来建立不同研究目的的模型，主要有急性、亚急性和慢性模型。急性 MPTP 给药主要引起 DA 能神经细胞非凋亡性死亡[42]，而长期施用低、中等剂量的神经毒素导致由凋亡性细胞死亡引起的进行性的神经变性，可以反映 PD 患者大脑中的细胞分子生物学变化[43]。MPTP 小鼠模型根据不同的研究目的其制备方式可以大致分为4种[44-45]：(1)前 PD 模型：一次小剂量 MPTP 腹腔注射(10～20 mg/kg) ，适用于代偿机制研究；(2)急性 PD 模型：间断 MPTP腹腔注射 (20 mg/kg) ，4 次/d，每2 h一次，连续1～2 d，大剂量时引起急性神经元变性坏死，常用于晚期 PD 的神经解剖、生化等研究；(3)亚急性 PD 模型：MPTP 腹腔注射 (20～30 mg/kg) ，1 次/d，连续5 d，神经损伤呈进行性加重，常研究反应较慢的代偿机制，如受体表达等[46-47]；(4)慢性 PD 模型：MPTP 腹腔注射(4 mg/kg) ，1 次/d，连续20 d。模型小鼠在急性中毒期会有症状表现，如瞳孔散大、竖毛、唾液过多及阵挛性癫痫发作等症状，一般注射后的15～30 min出现，但是能够很快恢复正常状态。当然，也有的实验没有观察到造模后小鼠的行为改变，原因可能与小鼠种属、年龄、药量或者 MPTP 敏感性的不同有关。所以，尽管模型小鼠有明显的类似自主活动减少之类的运动障碍症状，但很少能见到长时间典型的 PD 运动障碍。

研究[44]发现，慢性模型中小鼠中脑黑质部冠状切片的 TH 免疫组化染色更能表现出PD病理上的变化；通过观察 HE 染色切片，慢性模型组神经细胞数量减少，细胞形态改变，核仁染色较浅甚至消失，慢性模型更符合 PD DA 神经元凋亡的特性；爬杆和悬挂实验测试小鼠运动能力指标，慢性组比亚急性组小鼠爬杆时间更长，悬挂支撑时间也短，更能表现出 PD 在行为上的改变。综上所述，MPTP 制备的慢性 PD 小鼠模型更有代表性，更有利于进行 PD 动物实验研究。

4 结语

PD 动物模型中使用更多、应用范围更广的是神经毒性模型，此模型主要优势在于操作简单，成本较低，结果重复性较好。MPTP 模型在探讨 PD 发病原因和发病机制方面具有很大潜力，MPTP 模型被证明能成功的用于测试新型神经保护策略逆转或减缓疾病的进展。虽然研究者能够通过动物模型从不同的作用机制、不同的角度，全方面地模拟 PD 的发生，但是动物模型所反映的病理变化与 PD 患者现实表现出的病理病变与临床症状仍存在很大差异，因此，我们应更着眼于PD 动物模型的有效性与结果可重复性，不断完善 PD 模型制备方法，利用新兴科技技术尽早构建出可重复性高、成功率高、稳定且高度契合临床PD患者的动物模型。