李晓波 王 吉 王莎莎 李 威 秦 骁 黄宗文 岳秉飞 王淑菁 付 瑞
(中国食品药品检定研究院实验动物资源研究所,北京 102629)
鸽圆环病毒(pigeon circovirus, PiCV)为圆环病毒科圆环病毒属,无囊膜,直径约20 nm,基因组为单链环状DNA,大小约为2.0 kb,包含两个主要开放读码框架(ORFs):V1和C1,前者编码病毒复制相关的蛋白,后者编码病毒唯一的结构蛋白,即衣壳蛋白[1-2]。PiCV既可通过排泄物水平传播也可通过垂直传播[3],是导致幼鸽疾病综合征(young pigeon disease syndrome, YPDS)的病原体之一,患病鸽多为2~12月龄青年鸽,典型症状包括嗜睡、体质量减轻、厌食、作物反流、多饮和腹泻等,病毒也可破坏鸽的免疫系统,使其容易再次感染多种条件致病病原体,引起免疫器官衰退,导致气管、肝、肺及肠道的炎症等病理改变[2,4]。
目前PiCV还未能通过体外细胞成功培养增殖,因此主要依靠PCR方法检测其抗原[5-6],本研究选取其polymerase基因保守序列设计引物探针,建立了TaqMan探针实时荧光定量PCR(FQ-PCR)方法,可实现鸽样本中PiCV灵敏特异性的检测。
FQ-PCR引物探针由ABI公司合成,TaqMan Universal PCR Master Mix为ABI产品;病毒核酸提取试剂盒(TaKaRa公司)。
猪圆环病毒2型(PCV2),禽腺病毒 I 型、III 型(FAdv I、III),禽白血病病毒(ALV),禽网状内皮组织增生症病毒(REV)均购自中国兽药监察所;40份鸽肝、脾、肺、法式囊及36份鸽盲肠样本均采自北京某养殖场。
1.3.1引物设计:选择鸽圆环病毒(Genbank:NC_002361)基因保守序列设计引物和探针,序列见表1。
表1 PiCV FQ-PCR引物探针信息Table 1 Primers and probes for PiCV FQ-PCR
1.3.2病毒核酸的提取:猪圆环病毒2型(PCV2),禽腺病毒I型、III型,禽白血病病毒,禽网状内皮组织增生性病毒,各取0.2 mL病毒液按试剂盒说明提取核酸,最后用150 μL灭菌水洗脱。
1.3.3质粒标准品的制备:由上海生工合成PiCV(Genbank:NC_002361)全长(1~2 037 bp)DNA序列,转入pUC57质粒,构建质粒标准品pUC57-PiCV,经测定其浓度为3.48×1010copies/μL。
1.3.4PiCV FQ-PCR扩增体系及标准曲线的建立:对引物、探针浓度、退火温度等条件进行优化,优化后的反应体系为:TaqMan Universal PCR Master Mix 10 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL,探针(10 μmol/L)0.2 μL,DNA模板1 μL,灭菌ddH2O补足至终体积20 μL。反应程序为:50 ℃ 2 min;95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s;60 ℃ 1 min;40个循环。将质粒标准品pUC57-PiCV 10倍系列稀释为3.48×107~3.48 copies/μL,以其为模板,按上述反应体系和反应条件进行PCR扩增,每个稀释度做3 个平行,选取线性较好的7 个稀释度绘制标准曲线。
1.3.5PiCV FQ-PCR方法的敏感性验证
1.3.5.1 FQ-PCR方法检测限的验证:以3.48×107~3.48 copies/μL 10倍系列稀释的质粒标准品为模板,用优化好的反应条件进行检测,每个稀释度做3个平行,验证该方法所能检测的最低质粒标准品浓度。
1.3.5.2 与常规PCR方法敏感性比较:3.48×107~3.48 copies/μL 10倍系列稀释的质粒标准品,使用PiCV FQ-PCR方法及文献报道的常规PCR法分别进行扩增[7],比较FQ-PCR方法与常规PCR方法的敏感性。
1.3.6PiCV FQ-PCR方法特异性验证:用建立的荧光定量PCR法检测同为圆环病毒科的猪圆环病毒2型及禽腺病毒 I 型、III 型,禽白血病病毒,禽网状内皮组织增生症病毒等禽源病毒,验证方法的特异性。
1.3.7PiCV FQ-PCR方法的重复性和稳定性验证:应用优化好的反应条件,以浓度为3.48×105和3.48×104copies/μL的质粒标准品为模板进行FQ-PCR扩增,每个浓度设置6个重复,同时选择不同的3个时间点检测,计算组内和组间Ct值及定量拷贝数的均值、标准差及变异系数。
1.3.8PiCV FQ-PCR方法的应用:取鸽肝、脾、肺、法式囊样本各40份,盲肠36份,提取DNA,用建立的PiCV FQ-PCR方法检测。
用优化好的体系扩增3.48×107~3.48×101copies/μL的标准质粒,各稀释度扩增曲线间距均匀,标准曲线Slope为-3.381(-3~-3.5),R2值为1(>0.99),扩增效率为97.61%(90%~105%)(图1)。
图1 PiCV荧光定量PCR标准曲线Fig.1 PiCV FQ-PCR standard curve
如图2A所示,3.48×107~3.48×101copies/μL各稀释度的质粒标准品均出现S型扩增曲线,而3.48 copies/μL的3个平行实验有1个未出现S型扩增曲线,说明本方法最低可定量检测34.8 copies/μL的样品。用常规PCR方法检测同样的3.48×107~3.48×101copies/μL系列稀释的PiCV质粒标准品,由图2B可见,常规PCR最低可检测到3.48×103copies/μL,表明PiCV FQ-PCR方法敏感性比常规PCR方法高两个数量级。
A:PiCV荧光定量PCR敏感性;B:PiCV常规PCR敏感性;1~8:PiCV质粒标准品浓度分别为3.48×107~3.48 copies/μLA:The sensitivity of PiCV FQ-PCR; B: The sensitivity of PiCV conventional PCR;1-8:The concentration of PiCV plasmid standard is 3.48×107~3.48 copies/μL respectively图2 PiCV荧光定量PCR方法与常规PCR方法敏感性比较Fig.2 Comparison of sensitivity between PiCV FQ-PCR and conventional PCR
图3显示,当以PiCV为模板时,出现FAM荧光扩增曲线,以猪圆环病毒2型,禽腺病毒 I 型、III 型,禽白血病病毒,禽网状内皮组织增生性病毒为模板均无明显扩增曲线。表明所建立的荧光定量PCR法特异性强,与其他病毒均无交叉反应。
注:1~7分别为PiCV,猪圆环病毒2型,禽腺病毒I型、III型,禽白血病病毒,禽网状内皮组织增生症病毒及阴性对照Note: 1-7: PiCV、PCV2、FAdv I、FAdv III、ALV、REV and negative control图3 PiCV荧光定量PCR方法特异性验证扩增曲线Fig.3 PiCV FQ-PCR specificity test amplification curve
用建立的FQ-PCR方法检测3.48×105和3.48×104copies/μL两个浓度的质粒标准品,由表2可见,其Ct值及定量拷贝数组内变异系数为0.08%~1.63%,组间变异系数为5.10%~7.23%,均小于10%,表明方法的重复稳定性良好。
表2 PiCV FQ-PCR方法的重复稳定性验证结果Table 2 Repeatability verification results of PiCV FQ-PCR
用建立的PICV FQ-PCR方法对鸽肝、脾、肺、法式囊样品各40份,盲肠样品36份进行检测, 肝PiCV阳性率为97.5%(39/40)、脾、肺、法式囊PiCV阳性率均为100%(40/40),盲肠PiCV阳性率为97.2%(35/36)。肝、脾、肺、法式囊及盲肠病毒含量中位数(Q1,Q2)分别为3.39×104(2.61×102,2.69×106),9.53×104(4.74×102,3.90×106),4.61×104(1.10×103,4.87×105),3.34×105(5.54×103,1.80×107),2.69×104(1.82×103,1.15×106),经卡方检验,各组织PiCV含量无显著差异(P>0.05)。对阳性样本进行PCR扩增测序,与NCBI数据库比对,显示与鸽圆环病毒JF2/JiangSu/2014株同源性最高,一致率为97.85%。
荧光定量PCR方法具有灵敏度高,耗时少,特异性强等优点,可实现对病原体的快速精准检测[8-9],本研究通过比对NCBI PiCV各分离株序列,选取其polymerase基因保守序列设计引物和探针,建立了PiCV的荧光定量PCR检测方法。经验证,在标准质粒浓度为3.48×107~3.48×101copies/μL范围,产生的荧光CT值与质粒浓度呈线性关系,相关系数R2值为1,扩增效率为97.61%,表明建立的FQ-PCR方法可实现对PiCV的有效定量。用与PiCV同属的猪圆环病毒2型及其他禽源病毒,如禽腺病毒、禽白血病病毒等对照病毒进行方法特异性验证,对照病毒均未出现扩增信号,表明该方法特异性良好;用标准质粒进行方法敏感性验证,最低可检测到的质粒浓度为34.8 copies/μL,用传统PCR方法和建立的FQ-PCR方法扩增同一批系列稀释的质粒标准品,传统PCR方法的检测限为3.48×103copies/μL,检测敏感性比FQ-PCR方法低2个数量级;以两个不同浓度的质粒标准品对方法的重复性和稳定性进行验证,其Ct值及拷贝数值的变异系数低于2%,批间3个不同时间测定值的变异系数低于10%,表明该方法的重复性及稳定性良好。
据报道,鸽群中PiCV的感染率大约为70%,PiCV主要侵染法式囊、脾、胸腺等免疫器官,还可侵染肺、肝、肠、气管、肾等组织[4,10-14],本研究用所建立的荧光定量PCR方法对40只鸽的肝、脾、肺、法式囊及盲肠等样本进行检测,对方法进行应用研究,结果显示肝PiCV阳性率为97.5%(39/40),脾、肺、法式囊阳性率均为100%,这些鸽子来自北京某养殖场,反映出北京地区鸽群中PiCV有较高的感染率,而这40只鸽子均未表现出明显的临床症状,表明PiCV在鸽群中呈隐性感染,这与文献结果一致[2,13];各组织的PiCV定量结果显示,法式囊的病毒含量均值虽然比肝、脾、肺及盲肠高两个数量级,但由于其个体含量差异较大,统计学分析显示,各组织病毒含量无显著差异(P>0.05);对阳性PCR产物进行序列分析,显示与江苏株的同源性最高。
目前实验用鸽还未出台相关的国家标准和地方标准,本实验建立的PiCV FQ-PCR检测方法敏感性高,特异性及稳定性好,可有效检测到鸽组织样本中的PiCV,为制定实验用鸽相关的微生物标准提供了技术支持和基础数据。