慢性昼夜节律紊乱实验动物造模及其致病机制研究进展*

刘薇薇 于 洋 闻德亮

(中国医科大学健康科学研究院，沈阳 110122)

生物钟或称昼夜节律，是生物体以适应环境周期性变化而形成的内在节律。当环境发生变化时，身体可以通过感知外部线索(主要是光)来重新调整自己的生物钟。生物钟主要包括中央生物钟和外围生物钟。中央生物钟位于下丘脑的视交叉上核(suprachiasmatic nucleus, SCN)，被认为是昼夜节律的主要起搏器，通过感知环境中的光并整合信息形成24 h昼夜节律。此外，位于SCN的中央生物钟通过激素或突触将信号传递给外周生物钟，控制身体的昼夜节律。外周生物钟广泛分布在肠道、胰腺、心脏、肝、骨骼肌和肾等组织中，在昼夜节律中部分受中枢生物钟控制，同时它有自己的振荡器来调节各种组织器官的功能[1-3]。大多数生物钟成分是调节基因表达的转录因子，研究最广泛的时钟基因包括Bmal1(brain and muscle arnt like protein1，Bmal1)、Clock(circadian locomotor output cycles kaput，Clock)、Per1/2/3(Periods1/2/3，Per)和Cry1/2(Cryptochromes1/2，Cry)[4]。除了光，膳食营养[5-6]，睡眠[7]和运动[8]都会影响生物钟的调节作用。已知昼夜节律紊乱会导致包括代谢性疾病、中枢神经系统疾病等多种疾病的发生发展，而其内在调控机制尚不明确。因此，本文总结了多个昼夜节律紊乱实验动物模型便于相关研究的开展及机制深入探讨。

1 昼夜节律紊乱动物模型构建

1.1 核心生物钟基因敲除的干预模型

哺乳动物生物钟由几个核心的时钟基因组成，包括Clock、Bmal1、Per1、Per2、Cry1、Cry2，它们的蛋白质产物对于昼夜节律的产生和调节至关重要[4]，任何核心时钟基因的敲除都会破坏昼夜节律生理机能，进而导致昼夜节律紊乱。采用昼夜核心基因敲除来构造昼夜节律紊乱模型如：(1)Per突变仓鼠模型：如第一个被鉴定为昼夜节律突变体的哺乳动物是Per突变体仓鼠，与野生型24 h节律相比，它的昼夜节律为20 h[9]；(2) 肝细胞特异性Bmal1基因敲除小鼠模型和同窝小鼠对照研究发现，Bmal1肝细胞特异性基因敲除小鼠表现为肝糖原合成功能紊乱[10]；(3) 化学试剂或药物诱导Bmal1缺失小鼠模型，小鼠接受每天3次4 mg 他莫昔芬的腹腔注射，会导致Bmal1的缺失小鼠模型；(4) 通过物理射线方式诱导Bmal1缺失小鼠模型，使用伽马射线照射可得到Bmal1功能丧失小鼠突变体[11]。Bmal1-/-的小鼠会改变葡萄糖和胰岛素的分泌[12-13]，增加循环脂肪酸的浓度，从而导致肝和骨骼肌中形成异位脂肪[14]，因此根据实验目的不同，可选择不同手段针对不同的昼夜核心时钟基因进行动物造模。

1.2 光照位移诱导中央生物钟紊乱模型

SCN中央生物钟是整个生物钟的核心部分，处于独立自我维持振荡器层次结构的顶部，光是SCN中央生物钟最主要的外部影响因素[1]。光信息直接从含有内在光敏性黑视蛋白的视网膜神经节细胞通过视网膜下丘脑束到达SCN, 然后通过神经、体液和系统信号的组合将信息传递到大脑和身体的其余部分，带动外周时钟[15]。外部光照条件频繁变化会损害中央分子生物钟适应稳定节奏的能力，因此可采用不同光照位移诱导中央生物钟紊乱来构造慢性昼夜节律紊乱小鼠模型：(1) 单纯光照前移模型：如在Thaiss实验中，通过严格明暗循环照明，使8～9周的C57BL/6J小鼠具有稳定的昼夜节律，然后进行每3 d 8 h的光照相位的位移，模拟8 h的时差情况[16]；(2) 混合类型光照位移模型：Herrero的实验[17]中分3组进行不同方式的光照位移，高级组每5 d相位提前6 h，延迟组每5 d相位延迟6 h，高级-延迟组每5 d交替进行6 h 的相位提前和延迟。结果显示，3组中只有高级组的血清葡萄糖、胰岛素和瘦素水平最先下降，同时高级组的运动活动节律表现出最大改变，组织学检查显示脂质积聚，并显示棕色脂肪白色化，通过分析棕色脂肪与白色脂肪相关代谢物以及基因的表达显示高级组小鼠有明显肥胖趋势。由此说明不同的光线强度与波长也可能引起不同程度的时钟紊乱。

1.3 改变食物种类诱导昼夜节律紊乱模型

高脂肪饮食(high fat diet，HFD)可调控昼夜节律基因、调节时钟转录因子的核受体和参与下丘脑、肝和大脑中燃料利用的时钟控制基因的表达，因此可通过高脂肪饮食进行时钟紊乱动物造模。如将4周龄的小鼠随机分为普通饮食和高脂肪饮食(45%热量来自脂肪，20% 热量来自蛋白质，以及35%热量来自碳水化合物)，喂食6周，结果表明，高脂肪饮食可以延长小鼠自由活动的时间，同时减弱了饮食行为的昼夜模式，与正常饮食小鼠相比，高脂饮食小鼠在光照期间摄食增加而黑暗期间摄食减少，机制分析认为高脂饮食破坏了外周时钟基因表达和功能核激素受体的24 h表达模式，进一步发现核受体和下游代谢通路在肝与脂肪细胞的外周生物钟中不再同步，证明高脂饮食造成昼夜节律紊乱[18]。

1.4 改变进食行为影响昼夜节律紊乱模型

调节昼夜节律振荡器不仅存在于SCN中，也存在于大多数外周组织中，可以通过限时进食诱导外围节律振荡。使用10至16周龄的小鼠[19]，保持每天12 h正常光照时间，将小鼠随机分为白天喂食(早上6点到下午6点进食)，夜间喂食(下午6点到第2天早上6点进食)。发现限制进食会特别影响肝昼夜节律和胆固醇7α羟化酶、糖原合成酶、糖原磷酸化酶mRNA的积累，并对除肝以外其他脏器，如肾、心脏、胰腺等器官生物钟也产生了影响。而对SCN的体内电生理记录测量分析发现，SCN起搏器的相位没有任何改变。因此，改变进食时间会导致外围昼夜节律振荡器与中央SCN起搏器分离，并且不对中央起搏器产生影响。

2 昼夜节律紊乱参与生理信号调控

2.1 昼夜节律系统参与维持能量稳态

大约10% 的哺乳动物转录组显示昼夜节律振荡[20]。在已鉴定的节律基因中，许多基因在协调营养代谢方面具有特定作用[21]。例如，葡萄糖转运蛋白和胰高血糖素受体，以及参与糖代谢和胆固醇生物合成的多种酶，代谢相关的激素，如胰高血糖素、胰岛素、生长素释放肽、瘦素和皮质酮都会有节奏地表达和振荡[22]。下丘脑内有节律性控制促食欲信号，包括神经肽Y、甘丙肽和阿片黑素前体等协调代谢信号的关键区域。

2.2 生物钟核心基因的破坏影响新陈代谢

Bmal1-/-小鼠增加循环脂肪酸的浓度，导致在肝和骨骼肌中形成异位脂肪。当Bmal2-/-的Bmal-/-小鼠的节律性得到恢复时，胰岛素分泌与活动模式也会相继恢复[23]。此外，在中枢神经系统中回补Bmal1可以恢复运动活动节律，但不会改变新陈代谢的节奏[24]。这表明外周组织中的破坏对于代谢变化很重要。Per2基因的单一破坏会改变葡萄糖稳态，扰乱进食和糖皮质激素节律，并导致体质量显著增加[25]。

2.3 外周组织中时钟功能的丧失影响新陈代谢

改变肝和骨骼肌中的时钟基因表达会损害葡萄糖加工并改变胰岛素分泌[26]。胰腺Bmal1的缺失会降低其胰岛素分泌能力，这与小鼠活动或进食节律变化无关。肝特异性Bmal1缺失小鼠在禁食阶段表现出低血糖、过度的葡萄糖清除和肝葡萄糖调节基因的节律性表达丧失[27-28]。脂肪细胞中Bmal1的缺失会改变日常进食节律并导致肥胖[29]。

3 昼夜节律紊乱引起疾病的发病机制

3.1 昼夜节律紊乱对中枢神经类疾病的影响

昼夜节律紊乱的直接表现是睡眠的改变，研究发现Cry1与核心生物钟基因的显性编码变异相关，转录抑制Clock和Bmal1表达，Cry1基因突变会导致延长昼夜节律的周期，从而导致延迟睡眠障碍[30]。昼夜节律和睡眠障碍也是各种神经退行性疾病的标志，如阿尔茨海默病、帕金森病和亨廷顿病[31]。Bmal1缺失小鼠呈现显著的神经退行性疾病表型，包括严重的自发性星形胶质细胞增生、氧化损伤增加、突触变性、脑功能连接受损、学习和记忆受损、海马神经发生改变和癫痫阈值降低[32]。相关机制可能有以下几个方面: (1) 破坏昼夜节律功能可能会使大脑更容易遭受氧化损伤，从而加剧氧化应激引起的神经元死亡。(2) 由于生物钟紊乱引起的炎性反应，促使星形胶质细胞和小胶质细胞容易发生神经变性。(3) 昼夜节律时钟振荡使蛋白质的蛋白酶体降解，也表现出相应的振荡节律，生物钟节律紊乱同时也抑制了大脑通过自噬清除病原性蛋白质、预防神经变性的功能[33]。

3.2 昼夜节律紊乱对心血管类疾病的影响

在心脏中，大约13%的基因和8%蛋白质的表达具有节律性[34]。每天心肌细胞依次经历3个阶段：(1) ATP 生成阶段以促进活动期的收缩功能；(2) 活动期结束时的营养储存阶段；(3) 生长/修复阶段/ 睡眠期[35]。动物分子钟的中断会导致严重的心血管疾病，例如，小鼠中的Bmal1敲除会导致扩张型心肌病，降低每搏输出量和射血分数，并导致小鼠心力衰竭[36]。生物钟还通过调节 Kruppel样因子15的节律，将心脏中的离子平衡控制在健康范围内，缺乏或过度都会增加室性心律失常易感性[37]。

3.3 昼夜节律紊乱对胰腺的损伤

研究发现胰岛中的时钟中断会导致胰岛素释放不足和2型糖尿病。在离体胰腺分化的β细胞中发现被抑制的昼夜节律信号会严重阻断肽胞吐作用并导致胰岛素释放不足[38]。此外，昼夜节律紊乱会加重糖尿病患者基础胰岛素分泌障碍[39]。在饮食诱导肥胖下，β细胞特异性过表达Bmal1，会导致小鼠体内出现增强的胰岛生物钟振幅，改善肥胖及相关代谢性疾病[40]。

3.4 昼夜节律紊乱对肝的损伤

线粒体动力学(特别是分离融合和线粒体自噬)受昼夜节律的转录调节器Bmal1调控[41]。当生物钟的Bmal1功能丧失会导致肝中的线粒体肿胀，无法适应不同的营养条件，并伴随呼吸减弱和氧化应激升高，进一步发展为脂肪肝与胰岛素抵抗。生物钟紊乱还会加剧乙醇介导的肝糖原代谢紊乱，同时也表明长期饮酒会扰动肝生物钟破坏糖原代谢各个方面的时间依赖性变化，加速脂肪肝的发展[42]。

3.5 昼夜节律紊乱对肠道的损伤及肠道菌群失调的影响

昼夜节律会导致多种消化系统疾病。研究发现损伤的肠道组织再生依赖于Bmal1，Bmal1可调控TNF-α和p21等的合成与表达，Bmal1缺失会导致肠道的持续恶化[43]。肠道菌群是寄居在人体肠道内的微生物群，人体肠道内寄生的细菌数目40万亿个，基因总数约为人自身基因数目的150倍。自主神经系统负责调节胃肠道生物学过程，如免疫激活、肠道通透性、肠道微生物丰度等[44]。昼夜节律失调导致肠上皮屏障的破坏[45]。此外，肠上皮屏障完整性也受氧化应激、饮食成分、肠道微生物群和微生物代谢物的影响。肠道中的酶活性和营养吸收能力会随着昼夜节律转录调节而变化。Thaiss通过对小鼠进行每3 d光照相移的改变，模拟人们经历8 h时差改变，同时每4 h采集粪便进行16 s以及宏基因组学测定，发现经历光照位移小鼠粪便菌群的种类与丰富度发生显著改变，随后将粪便移植到无菌小鼠体内观察发现小鼠体质量明显增加，证明了节律紊乱通过微生物而影响机体代谢过程从而引起菌群的改变[16]。从结构上看，黏液层密度的昼夜波动也会影响与黏膜相关的微生物群落的组成，黏液层越靠近结肠末端越致密，其厚度有节律性波动[46]。微生物群通过昼夜节律转录因子NFIL3调节身体成分，NFIL3控制昼夜节律脂质代谢程序性表达并调节肠上皮细胞中的脂质吸收和输出，其昼夜节律振荡的幅度由微生物群通过先天淋巴细胞和上皮细胞生物钟控制。对于特异性NFIL3敲除小鼠扰乱了肠道菌群对于脂质摄取的调节和储存，从而引起肥胖、糖尿病和心血管疾病等代谢疾病的发生[47]。

4 小结

事实上，机体的大多数代谢过程都受到昼夜振荡的影响，现代社会许多外部环境的影响加剧了昼夜节律的紊乱，对人们的健康产生严重后果。通过构建相关实验小鼠模型我们建立起了在生物钟与代谢紊乱之间的分子联系，在研究昼夜紊乱、疾病与肠道菌群相互影响的疾病机制研究中，可以结合基因组、转录组、蛋白组、代谢组等多组学研究方法，找出与疾病相关的上下游机制，并找出影响代谢的靶细菌及其代谢产物，通过相应抗生菌或益生菌的应用来减轻慢性昼夜紊乱给机体带来的影响。