高效液相色谱法测定运动营养食品中黄曲霉毒素M1方法研究

戴云华 祁奇

摘 要：目的：建立运动营养食品中黄曲霉毒素M1的HPLC的检测方法。方法：样品经提取、过免疫亲和柱净化，再氮吹复溶后用高效液相色谱法测定其中黄曲霉毒素M1的含量。结果：黄曲霉毒素M1在0.05～5.00 ng/mL线性良好，回归方程Y=34 616X-68.307，相关系数R2=1，平均回收率为96.78%，检出限为0.07 μg/kg。结论：该试验所用方法简单方便，重现性较好，回收率较好，精密度良好，可用于运动营养食品中黄曲霉毒素M1含量的测定。

关键词：运动营养食品;黄曲霉毒素M1;液相色谱

Determination of Aflatoxin M1 in Sports Nutrition Food

by HPLC DAI Yunhua， QI Qi

（Changzhou Food and Drug Fiber Quality Supervision and Inspection Center， Changzhou 213000， China）

Abstract： Objective： An HPLC method for the detection of aflatoxin M1 in sports nutrition food was established. Method： The samples were extracted， purified by immunoaffinity column， reconstituted by nitrogen blowing， and the content of aflatoxin M1 was determined by high performance liquid chromatography. Result： The linearity of aflatoxin M1 was good in the range of 0.05～5.00 ng/mL， the regression equation was Y=34 616X-68.307， the correlation coefficient R2=1， the average recovery was 96.78%， and the detection limit was 0.07 μg/kg. Conclusion： The method used in this experiment is simple and convenient， with good reproducibility， good recovery rate and good precision， and can be used for the determination of aflatoxin M1 in sports nutrition food.

Keywords： sports nutrition food; aflatoxin M1; liquid chromatography

黃曲霉毒素（Aflatoxin，AFT）是一种强烈的致癌物质，是曲霉菌等菌类的高毒代物。1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织（World Health Organization，WHO）定为Ⅰ类致癌物，能使人体或动物的免疫功能丧失，诱导畸形、癌症的发生[1]。黄曲霉毒素M1的毒性和致癌性与黄曲霉毒素B1相当，因此含有黄曲霉毒素M1的牛奶危害很大[2]。多数政府机构都对人体和动物可摄入的黄曲霉毒素量有严格的法规限制。很多国家已经对牛奶和乳制品中的黄曲霉毒素M1含量有了明确的限量标准[3]。

运动营养食品是为满足运动人群的生理代谢状态、运动能力及对某些营养成分的特殊需求而专门加工的食品。为了满足营养补给，一般的代餐和蛋白棒中的主蛋白粉基本是浓缩乳清蛋白粉、浓缩牛奶蛋白粉等。我国食品安全国家标准中规定了乳及乳制品、含乳特殊膳食用食品、运动营养食品等各类别中AFM1的限量，但在《食品国家安全标准 食品中黄曲霉毒素M族的测定》（GB 5009.24—2016）中并没有涉及到运动营养食品中AFM1的检测方法。本文通过甲醇提取，由免疫亲和柱净化为前处理手段，氮吹复溶后通过液相色谱荧光检测器检测，建立了操作简单、灵敏度高、可广泛推广的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄曲霉毒素M1标准溶液（10.3 μg/mL），浙江农科院;黄曲霉毒素M1免疫亲和柱，上海必诺检测技术服务有限公司;甲醇、乙腈，默克股份两合公司;乳清蛋白棒，杭州衡美食品科技有限公司。

1.2 仪器与设备

LC-20ADXR高效液相色谱仪（带荧光检测器），岛津技迩（上海）商贸有限公司;Waters Symmetry C18色谱柱，沃特世科技（上海）有限公司;FOTECTOR PLUS全自动固相萃取仪，睿科集团股份有限公司;CP513电子天平（千分之一），奥豪斯仪器（常州）有限公司;高速冷冻离心机，赛默飞世尔科技（中国）有限公司;TurboVap LV氮吹仪，拜泰齐贸易（上海）有限公司;涡旋仪，德国IKA。

1.3 实验方法

1.3.1 标液配制

将标准品溶液储备液（10.3 μg/mL）用乙腈稀释成40 ng/mL的标准工作液，分别准确移取标准工作液12.5 µL、25.0 µL、50.0 µL、125.0 µL、250.0 µL、500.0 µL及1 250.0 µL至10 mL容量瓶中，用流动相定容至刻度，摇匀，配制成0.05 ng/mL、0.10 ng/mL、0.20 ng/mL、0.50 ng/mL、1.00 ng/mL、2.00 ng/mL和5.00 ng/mL的标准品溶液，进行分析。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）;流动相A：甲醇+乙腈（1∶1），流动相B：水;流速：1.0 mL/min;柱温：40 ℃;荧光检测波长：激发波长360 nm、发射波长430 nm;进样体积：50 μL。

1.3.3 样品前处理

（1）提取。称取1 g粉碎均匀的乳清蛋白棒（精确到0.001 g）于50 mL离心管中，加入4 mL 50 ℃热水涡旋混匀。加入10 mL甲醇，涡旋3 min。置于4 ℃、6 000 r/min下离心10 min。用玻璃纤维滤纸过滤至澄清。移取4.0 mL样品提取液至50 mL离心管中，用40 mL水稀释，混匀备用。

（2）净化。将上述样液以约1 mL/min的速度注入免疫亲和柱内，带样液滴完后，用10 mL水淋洗亲和柱，真空抽干亲和柱，然后用2 mL甲醇以1 mL/min的速度洗脱，收集全部洗脱液至刻度试管中。该步骤用了两种方法：①固相萃取仪，在设置净化方法时需注意上样的速度，上样后需清洗注射器，淋洗速度也要慢;②手动过柱，同样需要注意上样和淋洗的速度，经比对，回收率相差不大。固相萃取仪更方便，效率高。

（3）氮吹复溶。在50 ℃下氮气缓缓地将上述洗脱液吹至约0.5 mL，加入流动相复溶定容至1 mL，涡旋30 s溶解残留物，经0.22 μm微孔滤膜过滤后，用高效液相色谱仪分析。同时做空白实验。注意氮吹时不能吹干，以免造成AFM1的流失。复溶后要混匀。

2 结果与分析

2.1 实验结果

经检验，空白实验和样品乳清蛋白棒中的黄曲霉毒素M1均为阴性。黄曲霉毒素M1标样的液相色谱图见图1。

2.2 标准工作曲线

配制的黄曲霉毒素M1标准工作曲线浓度为0.05 ng/mL、0.10 ng/mL、0.20 ng/mL、0.50 ng/mL、1.00 ng/mL、2.00 ng/mL和5.00 ng/mL，以黄曲霉毒素M1浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，线性方程为Y=34 616X-68.307，R2=1。见图2。

2.3 检出限

将标准品溶液储备液稀释成一系列不同浓度的标准品溶液，分别为0.10 ng/mL、0.07 ng/mL、0.05 ng/mL和0.02 ng/mL，并进样分析，以3倍信噪比作为检出限，得出黄曲霉毒素M1的检出限为0.07 μg/kg。

2.4 精密度

取标准品溶液（1 ng/mL），连续进样6次，结果分别为0.980 ng/mL、0.977 ng/mL、0.986 ng/mL、0.988 ng/mL、0.978 ng/mL及0.979 ng/mL，黄曲霉毒素M1的RSD值为0.463%，表示精密度良好，实验结果较为满意。

2.5 重复性试验

取试样加标（加入浓度为3.5 ng/mL的黄曲霉毒素标准溶液0.1 mL），换算值为0.35 μg/kg，按照上述检验方法检测分析，测定6平行，结果分别为0.339 6 μg/kg、0.332 8 μg/kg、0.336 0 μg/kg、0.346 6 μg/kg、0.329 2 μg/kg及0.336 1 μg/kg，黄曲霉毒素M1的RSD为1.78%，可见重复性良好，实验结果较为满意。

2.6 回收率试验

取样品（样品空白显示阴性）1 g，加入浓度为3.5 ng/mL的黄曲霉毒素标准溶液0.05 mL、0.10 mL、0.50 mL（换算值为0.175 μg/kg、0.350 μg/kg、1.750 μg/kg），检测结果见表1，平均回收率為96.78%，从而可以看出此方法可以满足检测要求。

2.7 稳定性试验

取上述的重复性试验用试样，6 h进样一次分析，记录峰面积，结果显示，在24 h之内，峰面积相差不大，判定黄曲霉毒素M1的化学性质基本稳定。

3 结果与讨论

该研究方法基于免疫亲和柱对黄曲霉毒素吸附的专一性，在原始的HPLC方法上加以优化改进，找到最合适的净化和分离条件，利用HPLC的良好分离效果，达到了灵敏、准确的检测效果[4]。原标准中洗脱用的是4 mL乙腈，再氮气吹至近干，乙腈相对来说毒性比较大，氮吹至干的操作会直接影响最终测定结果的准确性[5]。经研究证明，用2 mL甲醇进行洗脱即可将黄曲霉毒素M1洗脱完全，氮吹也不能吹干，控制在0.5 mL左右，复溶至1 mL，结果证明测定结果较准确，回收率较高。本文建立了测定运动营养食品中黄曲霉毒素M1的高效液相色谱法，前处理并不复杂，荧光检测器灵敏度高，实验结果稳定性和重现性均较好，回收率高，是可切实推广的HPLC标准检测方法。

参考文献

[1]周贻兵，林野，李磊，等.高效液相色谱法测定牛奶中黄曲霉毒素M1的含量[J].食品研究与开发，2014，35（15）：96-98.

[2]郑荣，毛丹，王柯，等.HPLC法测定乳制品中的黄曲霉毒素M1[J].中国食品卫生杂志，2007，19（4）：318-319.

[3]武瑞霞，李云姣，霍超，等.乳及乳制品中黄曲霉毒素M1污染及检测技术研究进展[J].中国食品卫生杂志，2016，28（1）：124-128.

[4]白文静，吴新欣，刘谦，等.HPLC法测定乳制品中的黄曲霉毒素M1[J].安徽农业科学，2015，43（6）：270-271.

[5]黄亚伟，魏光，王若兰，等.乳品中黄曲霉毒素M1检测方法研究进展[J].食品安全质量检测学报，2014，5（3）：770-775.

作者简介：戴云华（1985—），女，江苏金坛人，本科，工程师。研究方向：食品检验技术。

祁奇（1994—），男，江苏连云港人，硕士，助理工程师。研究方向：食品检验技术。