微生态制剂活菌的计数方法分析

苏梦缘，伍新叶，朱 曦，王茜瑛，邵 嫄，李克克，梁运祥，李英俊

（1.华中农业大学生命科学技术学院，武汉 430070；2.河南金百合生物科技股份有限公司，河南 安阳 455000）

微生态制剂能够调节和维持微生物生态平衡，在畜禽水产养殖中得到较为普遍的应用，可以改善环境、促进动物生长、改善畜禽水产品品质、提高饲料利用率，从而实现预防疾病、绿色健康养殖。活菌数为微生态制剂质量与安全性的重要考察指标，能够直观地展示微生态制剂质量，较高的活菌数可以一定程度反应微生态制剂的有效活性和保存的稳定性。微生态制剂活菌数的技术方法复杂多样，对各种计数方法进行系统了解和对微生态制剂生产和应用进行分析均具有重要意义［1］。对平板培养法、直接染色观察法、流式细胞术检测法、MTT 计数法、MPN-PCR 检测法、实时荧光定量法、ATP 生物发光法、Bactec 9120 血培养仪法、高通量生长曲线法、滤膜法（浓缩法）、颜色改变单位法（CCU）、LAMP 环介导等温扩增法等12 种活菌计数法进行了系统介绍和优缺点分析与总结，为相关研究和应用提供参考。

1 常见活菌计数方法及其原理

1.1 平板培养法

平板培养法包括稀释涂布平板法和稀释倒平板法，两者的区别在于，前者是将稀释过后的待测样品涂布于培养基上，后者是将稀释后的待测样品与培养基混匀后进行倒板。该方法计数准确性高，常作为其他计数方法的参照，在各个领域广泛应用，同时也在不断被优化和改良。例如，Takano 等［2］在强酸条件下使用琼脂平板和结冷胶平板培养嗜酸性细菌，评估了两种平板在酸性条件下细菌培养时间和菌落分离平板培养方法的极限范围。平板培养法也存在一定局限性，比如对厌氧微生物进行计数就需要将平板置于严格的厌氧培养环境；同时，平板培养法依赖于微生物的生长，需要较长的培养时间，难以实现快速检测。

1.2 直接染色观察法

直接染色观察法是通过细胞膜的完整性以及细胞代谢活性等来区分活菌和死菌。其原理为活菌细胞膜完整且代谢正常，不易与染料结合，呈现出无色；死菌细胞膜不完整且无代谢活性，易与染料结合，从而显出颜色。细胞经染色后，利用显微镜观察计数，便可区分活菌和死菌。常用的染料有锥虫蓝、台盼蓝、刚果红、亚甲蓝（美蓝）等。其中，亚甲蓝由于没有毒性而被广泛应用。亚甲蓝在氧化状态时呈现出蓝色，还原态时呈无色。在进行活体染色时，亚甲蓝染料可与活细胞代谢物中H+结合从而被还原，呈无色；死细胞因不进行代谢活动，脱氢酶失去活性，亚甲蓝不能被还原，因此死细胞被染色且呈蓝色或淡蓝色。美蓝染色法也存在一些不足，①细胞染色若较浅，会使判断准确度降低。②染色时间或计数时间的长短会影响观察染色效果，对结果的准确性造成影响。③细胞形态的异常会对检测结果造成影响。

直接染色观察法操作简单，成本低，但需要使用显微镜观察，计数工作量大、耗时长，对操作者有一定的技术要求，检测准确度不稳定，不适合大规模检测应用［3］。

1.3 流式细胞术检测法

流式细胞术（Flow cytometry，FCM）属于定量分析技术，核心仪器为流式细胞仪，可以同时对单个细胞的多项参数进行定量或定性分析。

利用FCM 对活菌进行计数的原理是，用特异性荧光信号对细胞进行标记，用流式细胞仪测定标记细胞，统计活菌个数。传统的基于荧光信号的流式细胞术也存在局限，其检测的目标参数较为单一，数据处理过程较为复杂。在进行多次技术改进后，已开发出了更多适用于细胞计数的流式细胞术，如定量流式细胞术、多色流式细胞术、磷酸化流式细胞术、流式微球分析技术、质谱流式细胞术、成像流式细胞术和体内流式细胞术等［4］。

该检测法的优点在于检测参数多，无需细胞培养过程，检测速度快，最高可达每秒上万个细胞，检测结果精度高，准确性好等；缺点在于检测仪器昂贵，检测费用高，不同待检菌株在灵敏度上存在差异，对于复杂样品，需要进行预处理才能用于检测。

FCM 在医学诊断中具有较大的开发价值，可用于检验白血病患者的外周血白血病细胞［5］、研究外周血淋巴细胞DNA 受到铅损伤的情况等［6］。

1.4 MTT 计数法

MTT 是一种噻唑盐，化学名为3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐。MTT 计数法是Mosmann［7］提出的。MTT 水溶液为黄绿色，容易穿过细胞膜，与活细胞线粒体中的琥铂酸脱氢酶进行反应，被还原成蓝紫色不溶于水的甲瓒［8］。死细胞没有代谢，脱氢酶无活性，没有还原反应，MTT 颜色不发生变化。测定溶液的吸光度（OD555nm）或利用有机溶剂如二甲基亚砜（DMSO）溶解甲瓒再测定吸光度，则可测出活细胞数［9］。

MTT 法有快速、准确、工作量小、能区分活死细胞等优点，使用范围较广，多用于动物细胞活菌计数、细胞毒理试验、微生物活菌计数等。但当活菌数较低或较高时，MTT 的反应产物会过低或过高，导致所测吸光度超出检测范围。因此MTT 检测法不适用于浓度太低或太高的细菌液［10］。

1.5 MPN-PCR 检测法

MPN-PCR 检测法又称最大可能数法，与稀释平板检测法有一定的联系，但却是间接与泊松分布相关的一种计数方法［11］。该方法一般是将待测样品进行10 倍梯度稀释，每个梯度设3 个平行，在适当条件培养后使用PCR 扩增计数进行测定。若样品中含有目标菌，则依据观察到的PCR 阳性管数，检索MPN 表，得出样品中目标菌的MPN 值，得出待测菌的数量，也叫九管法［12］。

1915 年Mc Crady 利用MPN 最大可能数法估算细菌浓度［13］。该方法适用于测定在混杂的微生物群中虽不占优势，却具有特殊功能的类群。例如检测特殊的土壤微生物群、牛奶或食品中特殊微生物类群（如大肠杆菌）数量，还可进行污水检测［14］。

1.6 实时荧光定量法

实时荧光定量法（Quantitative real-time PCR）的原理是基于标准PCR 技术，在扩增反应中加入荧光基团，使用能够进行热循环和荧光信号筛查的仪器，在每次循环后，对荧光信号进行检测，进而得到靶核酸的含量，荧光信号和扩增片段的数量成正比。该种方法具有特异性高、灵敏度高、检测周期短、能够检测活的但不可培养（VBNC）状态下的细胞、自动化程度高等优点。缺点在于无法对死菌和活菌DNA 进行区分。

在检测嗜肺军团菌时，由于该菌能够“隐藏”于变形虫体内，且生长速度缓慢，不适合使用传统的培养计数法进行计数，因此qPCR 检测技术被认为是一种嗜肺军团菌潜在风险量化方法［15，16］。此外，qPCR 技术还被用来度量不同紫外光照射后DNA 的损伤程度［17］。

叠氮溴化丙锭（PMA）是一种光敏性DNA 结合染料，自身荧光弱，具有高亲和力，在结合核酸后，荧光信号会大幅度增强。在进行DNA 提取前，将待测样品与PMA 混匀，PMA 会有选择性地与膜损伤细胞中的双链DNA 作用，嵌入其中。在464 nm 的可见光的作用下，PMA 分子中的叠氮基团分解，产生具有高活性的氮烯类化合物，和DNA 分子共价交联产生沉淀，抑制qPCR 过程中膜损伤细胞DNA 的扩增。溶液中残留的过量染料与水分子可在光照的条件下产生反应，生成羟胺化合物，使过量染料失去交联活性，对后继活细胞DNA 的扩增不存在影响。

PMA 的选择渗透性和qPCR 的特异性相结合，能够大幅度提高检测速度和灵敏性［18］。庞贝妮等［19］依据PMA/EMA-qPCR 活菌检测机理，对试验的曝光时间和染料浓度等因素进行优化，确认EMA-qPCR检测方法适合作为沙门氏菌活的一种初筛方法。在食品工业中，PMA/EMA-qPCR 和qPCR 等方法均有较广泛的应用，在确定最佳PMA 浓度的情况下，用PMA-qPCR 检测保加利亚乳杆菌sp1.1［20］、乳品中酵母菌［21］、牛奶中的蜡样芽孢杆菌［22］等，EMA-qPCR检测单核细胞增生李斯特氏菌［23］、丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种［24］、水样中弯曲杆菌［25］等，能够更好地对活细胞进行区分和计数。

影响PMA-qPCR 检测效率的因素有微生物细胞膜结构差异、微生物待扩基因的选择、PMA 浓度、暗反应时间和光反应条件。

1.7 ATP 生物发光法

三磷酸腺苷（ATP）是所有生命活动的能量载体，ATP 的含量在活菌中会保持在一定范围内，若细菌死亡，则ATP 会被胞内酶在短时间内快速分解，所以可用ATP 的含量反映样品中的活菌数。

ATP 生物发光法的原理是荧光素酶在Mg2+催化下使荧光素与ATP 反应形成荧光素-AMP 复合物，并产生焦磷酸（PPi）。当复合物被O2氧化后，会形成激发态复合物，并产生CO2，当激发态转化成基态时会释放能量而发光。在一定范围内，发光强度与ATP 浓度呈线性关系，从而检测活菌的数量［26］。

ATP 生物发光法简便、快速、重现性好、可检测出不可培养的微生物，但是要求样品细菌浓度至少满足1 000 CFU/mL，需要富集样品菌落总数达到有效检测范围才能准确检测，检测灵敏性有待加强［27-29］。传统的ATP 生物发光法测定的是总ATP，对活菌数检测会造成误差，盐浓度也会影响检测结果［30］。将ATP 生物发光法与免疫磁分离技术（IMS）相结合，可以浓缩分离样品对微生物进行特异性识别，提高检测灵敏性。该方法由Lee 等［31］应用到水中大肠杆菌含量的检测。Cheng 等［32］研究了生物免疫纳米磁微粒（BMNPs）技术与ATP 生物发光法的结合，该方法可检测更多微生物，并降低检测限。Hammes 等［33］对ATP 生物发光法进行了优化，大幅降低其检测限（可达0.000 1 nmol/L），并将活菌ATP和胞外ATP 进行了区分。

1.8 Bactec 9120 血培养仪法

Bactec 9120 血培养系统进行活菌计数的原理为，微生物细胞在培养瓶中代谢产生的CO2会激活瓶底中的感应物质而产生荧光，荧光信号的强度和CO2的生成量成正比，将该荧光信号经过一定的计算，就可以对微生物的数量和生长情况进行判断。该方法在临床活菌计数中具有较大应用价值［34］。

1.9 高通量生长曲线法

高通量生长曲线法是在实时定量PCR 的扩增曲线原理的基础上，根据微生物的指数生长曲线而建立的［35］。该方法在设置特定浊度后，根据细菌培养到达该浊度的时长进行活菌计数。使用微孔板进行培养，设置多个平行，对微生物进行高通量实时监测，进行活菌计数。高通量生长曲线法也适用于辅助检验消毒剂的杀菌抑菌作用，相比于MTT 比色法，高通量生长曲线法计数更加准确，并且其线性范围更宽［36］。该方法无需特别试剂，不会被特殊试剂的缺乏所限制。缺点在于检测过程较耗费时间，需要测定吸光度。在具备自动化仪器的情况下，操作会简化，且测量精度和范围将进一步优化［37］。

1.10 滤膜法（浓缩法）

该方法主要是通过微孔薄膜将待测样品进行过滤富集，再把薄膜在培养基或浸有培养液的支持物表面上培养，通过菌落数计算样品含菌数，适用于测定空气、水等体积大而含菌低的样品中的活菌数。

1.11 颜色改变单位法（CCU）

颜色改变单位法适用于用比浊法无法计数的微小微生物。以支原体为例，由于培养液完全澄清透明，无法用溶液浊度来进行菌体计数，所以采用菌体代谢活力的数据变化进行菌体计数。该方法主要步骤是把样品进行10 倍梯度稀释，在适宜温度下培养，把颜色改变的最末一管作为待测样品的CCU［38］。该计数方法的结果会比实际偏低，可以通过减小稀释梯度来改善，但会加大工作量。该方法在医学研究方面广泛应用［39-41］，有待进一步对各种支原体的计数梯度进行研究，扩展其适用范围。

1.12 LAMP 环介导等温扩增法

2000 年，Notomi 等［42］报道了环介导等温扩增法，该方法需要根据目的基因设计一对外引物和一对内引物，有时也需要2 个环引物，总共需要4 或6条引物，在Bst DNA 聚合酶的作用下对目的基因进行扩增，环引物的增加可以提高检测效率，但容易出现假阳性，可以与其他技术联用进行改善。

LAMP 环介导等温扩增法与PCR 相比，不需要热循环设备，是一种高效、特异性高的计数方法，应用范围广［43-45］，被应用于食品安全检测［46］、人类疾病监 测［47，48］、动 植 物 疾 病 监 测［49］等 方 面。传 统 的LAMP 环介导等温扩增无法区分死菌和活菌，会造成假阳性。该技术与DNA 荧光染料PMA 联合使用［50］，也可利用RNA 的不稳定性建立实时荧光RTLAMP 检测方法［51］来区分死菌和活菌，避免假阳性。该方法有成本低，特异性高等优点，在实际中具有较大的应用潜力。

2 12 种检测方法的比较

12 种活菌检测方法的比较见表1。

表1 12 种活菌检测方法的比较

3 讨论

活菌数作为微生态制剂的重要指标，反映微生态制剂的质量和稳定性。随着活菌计数方法和仪器的开发与优化，活菌计数越来越准确、高效和快速。在活菌计数中，平板培养法的应用较为广泛，通常被用做其他计数方法的参照。但是，平板计数法耗费时间长，在指导工业发酵生产的应用中有所限制，而基于核酸检测的PMA/EMA-qPCR 检测法、环介导等温扩增等方法由于耗时短、操作简单等优点，具有较大的潜力，值得重点关注和研究。