苜蓿提取液对大肠埃希菌体外抑菌活性

刘耀川，龚商羽，关 淼，杨洺扬，申贯男，李 旭，郭首龙

（1.辽宁省动物疫病预防控制中心，沈阳 110164；2.锦州市动物疫病预防控制中心，辽宁 锦州 121000）

大肠埃希菌是自然界广泛存在的一种共栖型微生物，通常为条件性致病菌，以其他疾病的并发致病菌或继发致病菌的形势存在［1］。该菌血清型众多，其中部分特殊血清型的大肠埃希菌能引起人和动物感染，而 O1、O2、O18 及 O78 则是引起禽大肠杆菌病的主要病原。该病是禽类养殖过程中的常发疾病，具有较高的发病率及死亡率，给禽类养殖业带来较大的经济损失［2］。兽医临床仍然选择抗生素作为禽大肠杆菌病的主要治疗手段，随着抗生素的使用，大肠埃希菌在药物选择压力的作用下逐渐产生耐药性，给畜牧养殖业造成严重威胁，急需寻找有效的抗生素替代治疗方案。

苜蓿（Medicago sativa）是种植面积广泛的优良牧草，具有较好的环境适应能力及较高的营养价值。同时作为古籍记载的中药，苜蓿具有较好的清热、通淋、利血等功效，对黄疸、尿路结石、细菌性腹泻等疾病有一定疗效。本试验对苜蓿提取液体外抑菌活性进行研究，旨在为苜蓿精加工及减抗治疗奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要仪器

Eppendorf 5810R 冷冻低温离心机，北京鹏昆科贸生产；艾龙特QG-H 生物安全柜，山东潍坊医疗器械厂生产；DZ-380L-X 高压立式蒸汽灭菌器，上海申安医疗生产；Herocell 180DX 隔水式恒温电热培养箱，上海润度生物科技有限公司生产；精科752N 紫外/可见光分光光度计，上海仪电分析仪器有限公司生产；KQ-450DX 数控超声波清洗器，舟山市超声仪器有限公司生产；SHV-IB 型双A 循环水多用真空泵，郑州长宏科贸有限公司生产；艾本德 10、200、1 000 μL 微量移液器，青岛兴达生物科技生产。

1.2 主要试剂

营养肉汤（NB）、麦康凯琼脂粉、营养琼脂（NA）于北京奥博星生物技术有限责任公司购买；肠杆菌科细菌生化编码鉴定管于杭州滨和微生物试剂有限公司购买；芦丁对照品（批号F20201108）于国药集团购买；其他化学常用试剂如氢氧化钠、乙醇（分析纯）、氯化铝、亚硝酸钠等，由辽宁省动物疫病预防控制中心提供。

1.3 方法

1.3.1 芦丁标准曲线的绘制 精确称取芦丁标准品0.100 4 g，定容于50 mL 容量瓶中，充分摇匀后3 倍稀释，所得芦丁标准溶液的质量浓度为0.67 g/L［3］。

分别取配置好的标准溶液 2、4、6、8、10、12 及14 mL 于50 mL 容量瓶中。按照5 mL 5% NaNO26 min、10 mL 1% Al（NO3）36 min、20 mL 4% NaOH 15 min 的顺序进行反应后，定容、摇匀。以ddH2O 为对照，在510 nm 波长处测定其OD值，绘制标准曲线［4］。

1.3.2 苜蓿黄酮化合物提取及浓度测定 根据董晓宁等［5］报道的最佳提取方案，按照液料比1∶45、乙醇体积分数55%、超声提取时间50 min 的工艺对苜蓿进行提取。具体方法为，精确称量10 g 苜蓿粉末，在烧杯中加入55%的乙醇溶液，封口静置于室温环境浸泡5 h。将浸泡液于300 W 功率超声处理50 min，减压抽滤后进行旋转蒸发，直至浓缩液无明显乙醇味后，将浓缩液于锥形瓶中用0.02 g 活性炭进行脱色处理。定容50 mL 后，用亚硝酸钠-硝酸铝显色法处理，在510 nm 处测定OD值，根据标准曲线测定黄酮化合物含量。

1.3.3 培养基制备 将营养肉汤、营养琼脂、麦康凯琼脂按照说明书要求配置成相应浓度培养基，经121 ℃高压蒸汽灭菌20 min 后分装于离心管及制成相应的固体培养基。并将装有营养琼脂的离心管、固体麦康凯培养基及固体营养琼脂培养基放置于37 ℃恒温培养箱中过夜检菌。将检菌合格的培养基密封，保存于4 ℃冰箱内备用。

1.3.4 大肠埃希菌分离及鉴定 用无菌棉拭子取患病鸡泄殖腔样品，并将棉拭子置于盛有无菌生理盐水的离心管中4 ℃密封保存并尽快送至实验室。在洁净工作台中取100 μL 生理盐水样品，用三角玻璃棒均匀涂布于普通琼脂培养基中，并于37 ℃恒温培养箱中培养12 h。选取菌落大小、形状不同的单菌落于无菌NB 中进行扩增培养，并将培养液于麦康凯琼脂培养基进行初步鉴别培养，培养方法及条件与普通琼脂培养基方式相同。选取麦康凯培养基中圆形且具有红色金属光泽的单独菌落，对其进行生化反应鉴定。根据颜色反应及编码手册对应编码，最终确定大肠埃希菌分离株。

1.3.5 体外抑菌活性研究 将大肠埃希菌分离株接种于无菌NB 肉汤中，于37 ℃振荡培养箱中180 r/min 过夜培养。取 100 μL 浑浊 NB 培养液，均匀涂布于普通琼脂培养基中，于37 ℃恒温培养箱中培养24 h 进行菌株复壮。

取复壮后的单独菌落于NB 肉汤中振荡培养，用无菌NB 肉汤为对照测定培养物OD值，待菌液OD600nm为0.4～0.6，此时菌液浓度约为1×108CFU/mL，可用于药物敏感性试验。参考美国CLSI 2019 年推荐的微量肉汤稀释法测定苜蓿提取液对大肠埃希菌分离株的最小抑菌浓度（MIC），以大肠埃希菌标准株ATCC25922 为质控菌，设置氨苄西林标准品为对照。

2 结果与分析

2.1 苜蓿提取液黄酮化合物含量

根据芦丁标准品绘制的标准曲线，以及用芦丁比色法测定的苜蓿提取液吸光度，测得苜蓿提取液中黄酮类化合物含量为9.63 mg/mL。

2.2 大肠埃希菌分离鉴定结果

在63 个临床病例的泄殖腔棉拭子中，经麦康凯琼脂鉴别培养基初步分离到大肠埃希菌52 株。52株大肠埃希菌疑似分离株经肠杆菌科生化反应鉴定培养、编码比对，最终确定大肠埃希菌分离株42 株，大肠埃希菌分离率为66.7%。

2.3 苜蓿提取液体外抑菌活性

采用微量肉汤稀释法分别测定氨苄西林标准品和苜蓿提取液对42 株大肠埃希菌分离株的MIC，以大肠杆菌标准株ATCC25922 作为质控菌。结果表明，氨苄西林标准品对质控菌的MIC 为0.25 mg/L，符合CLSI评估范围，证明该数据及试验操作可信。

氨苄西林标准品对42 株大肠埃希菌分离株的MIC50和 MIC90分别为 0.5、8.0 mg/L，其整体 MIC 为0.125～64.000 mg/L，部分分离株对氨苄西林已产生耐药性。

本研究苜蓿提取物按其黄酮化合物含量计算，原液初始浓度为9 630 mg/L。按倍比稀释计算，抑菌活性研究中工作液浓度为9.404～9 630.000 mg/L。其对大肠埃希菌分离株MIC50和MIC90分别为1 203.75、4 815.00 mg/L，其MIC为601.87～9 630.00 mg/L（表1）。

表1 大肠埃希菌分离株体外抑菌活性研究结果

3 讨论

禽大肠杆菌病是由大肠埃希菌引起的一类原发或继发性禽类传染病，其主要症状为心包炎、滑膜炎、大肠杆菌性肉芽肿、脐炎、蜂窝组织炎等，对规模化养殖威胁巨大。随着大肠埃希菌耐药菌株的出现，该病的治疗也愈发困难。苜蓿是一种在中国分布较广的多年生草本植物，在中国畜禽养殖业已作为优良牧草长期使用。近代医学研究发现，其含有的活性物质对常见病原菌及耐药性病原菌具有一定的抑制功能。杨蕾等［6］报道苜蓿黄酮提取物对云南地区分离的枯草芽孢杆菌、普通变形杆菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的MIC 分别为1.5、1.5、3.0、2.0 和 2.5 mg/mL；廖天录等［7］报道航天苜蓿中黄酮提取物对甘肃地区大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的 MIC 为 0.4 和 0.7 mg/mL；李波等［8］报道苜蓿皂苷提取物对齐齐哈尔地区大肠埃希菌和枯草芽孢杆菌的 MIC 分别为 0.024 0、0.047 9 mg/mL，对真菌无明显抑制效果；卢小康等［9］报道苜蓿提取液对甘肃地区绿脓杆菌、停乳链球菌、大肠埃希菌及金黄色葡萄球菌的 MIC 分别为 0.674、1.347、2.695 及2.695 mg/mL；王家皓等［10］报道南苜蓿叶总黄酮提取物对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌标准株的MIC 分别为0.15、0.20 mg/mL。

本试验苜蓿黄酮提取液对禽源大肠埃希菌分离株的 MIC50和 MIC90分别为 1 203.75 、4 815.00 mg/L，对苜蓿提取液体外抑菌活性研究发现，提取液对临床分离的大肠埃希菌具有一定的抑制效果，部分分离株对提取液敏感性较高，在相对较低浓度时（601.87 mg/L）就出现明显的生长抑制效果。而部分分离株则对提取液不敏感，在初始工作浓度时仍正常生长，未见明显的生长抑制现象。对氨苄西林耐药菌株MIC 分析，并未发现明显的耐药菌株抑制活性，即对部分氨苄西林耐药菌株表现出生长抑制效果，而对部分氨苄西林耐药菌株未见生长抑制。分析可能是黄酮类化合物抑菌机制与β-内酰胺类抗生素抑菌机制不同。