秋水仙素诱导黄蜀葵多倍体

孙 哲 ，张 辉，李澳旋 ，杜晓蓉 ，王永生 ，乔永刚

（1.山西农业大学生命科学学院，山西 太谷 030801；2.中兽医药现代化山西省重点实验室，山西 太谷 030801；3.山西海雪农业科技有限公司，山西 灵石 031300）

黄蜀葵［Abelmoschus manihot（Linn.）Medicus］是锦葵科、秋葵属一年生或多年生草本植物，又名金花葵，多产于河北、河南、山东等地，较早记录于《嘉祐本草》［1］。黄蜀葵的花朵不仅观赏价值高，而且富含金丝桃苷等黄酮化合物以及Fe、Cu、Mn 等微量元素［2］，其具有消炎镇痛、调节血脂和清热解毒等功效［3］。黄蜀葵各部位营养丰富，具有多种维生素及氨基酸，有较高药用价值和营养价值［4-8］，具有预防高血压、高血糖和高脂血症等作用。

多倍体在自然界普遍存在，随着现代技术的发展和多倍体研究的不断深入，多倍化已广泛应用于植物进化［9］。获得多倍体植物的主要途径有物理诱导、化学诱导等［10，11］，物理诱导多通过射线处理、极端温度、温度骤变等方法，但是诱导效率很低，在实际操作中很少使用；化学诱变是使用秋水仙素处理正在分裂的细胞，是加倍效果好、使用广泛的方法。此外，还有使用离体培养在植物伤口处形成愈伤组织，进一步发育成多倍体的方法［12］。

中国药用植物资源丰富，栽培历史悠久。多倍体药用植物具有耐储藏运输、抗逆性强、药用成分增加、产量增高等优点［13-15］，黑果枸杞、锦鸡儿、北苍术、萱草、丹参等药用植物的多倍体研究已取得较大进展［16-20］。对于黄蜀葵的研究多集中在栽培技术以及成分分析方面［21-27］，对其多倍体研究较少。本试验采用秋水仙素处理法处理黄蜀葵幼苗，获得多倍体黄蜀葵植株，通过形态学和细胞学鉴定，为多倍体黄蜀葵的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黄蜀葵种子来自山西海雪农业科技有限公司。试验于2021 年3—10 月在山西农业大学生命科学学院进行，挑选黄蜀葵种子种植于营养钵中，对其进行秋水仙素处理。

多倍体诱导和鉴定的试剂为秋水仙素（0.1%、0.2%）、1%琼脂溶胶、1%碘-碘化钾溶液等。

1.2 试验方法

1.2.1 诱导方法 采用改良初生分生组织处理法进行诱变，选取颗粒饱满的黄蜀葵种子置于烧杯中浸泡24 h，在营养钵中进行播种，选取长势相同的植株进行处理。共有6 个试验组和1 个对照组，每个试验组处理54 棵幼苗，秋水仙素设置0.1%、0.2%两个浓度梯度，每个浓度下设置3 个处理时间，分别为24、48、72 h。待种子发芽生长至两片子叶展开时，将配制好的秋水仙素琼脂凝胶水溶液加热并充分搅拌至40 ℃呈半固体状态，涂抹到刚萌发的顶芽上，充分包裹嫩芽，黑暗处理7 d，黑暗处理期间不浇水。不同浓度秋水仙素处理和时间组合如表1 所示。

表1 秋水仙素诱导浓度与时间

1.2.2 黄蜀葵变异株的形态观察 ①成活率与变异率统计。暗处理的植株没有出现萎蔫等病理状态，统计为成活株数。计算公式为，成活率=（成活株数/总株数）×100%。植株正常生长后，处理组与对照组相比，出现明显的植株矮小、茎部膨大、叶片畸形等多倍体植株常见的形态学性状，统计为变异植株。计算公式为，变异率=（变异株数/成活株数）×100%。②形态学观察。在暗处理结束后，待植株生长归于正常，统计成活幼苗和死亡幼苗的数量并记录；35 d 后，记录诱变成功的植株数；随机选取试验组和对照组中的试验材料各5 株，测量其株高，对植株第3 片真叶的长、宽进行测量并记录，并计算叶形指数（叶长/叶宽）；③细胞学观察。表皮气孔的观察，分别取试验组和对照组植株的第3 片真叶，用镊子撕下下表皮，将其放在载玻片上加一滴1%碘-碘化钾染液，静置15 min，在显微镜下观察，随机选取5个保卫细胞，测量保卫细胞以及气孔的长度和宽度，观察固定视野内气孔的数量并确定气孔密度。

1.3 数据分析

使用Excel与SPSS 软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理对黄蜀葵幼苗成活率和形态变异率的影响

由表2 可知，当处理浓度为0.1% 时，A1 组合成活率最高，为85.19%，变异率最低，为47.83%；A3 组合成活率最低，为51.85%，变异率最高，为64.29%。当处理浓度为0.2% 时，B1 组合成活率最高，为55.56%，变异率最低，为70.00%；B3 组合成活率最低，为27.78%，变异率最高，为100.00%。同一时间处理下，B 处理成活率均小于A 处理，而变异率均大于A 处理。所有处理成活率大小为CK＞A1＞A2＞B1＞A3＞B2＞B3，变异率大小为 B3＞B2＞B1＞A3＞A2＞A1＞CK，同一处理条件下，成活率与变异率呈反比关系。

表2 不同处理对黄蜀葵幼苗的成活率和变异率的影响

2.2 不同处理对黄蜀葵幼苗形态指标的影响

黄蜀葵幼苗经过不同浓度不同时长的秋水仙素处理后，植株形态会出现明显差异。与CK 植株相比，变异株明显矮小（图1A）；其根系明显变长（图1B）；其叶片出现皱缩、畸形、增厚、颜色加深等情况（图1C、图1D），表明秋水仙素处理会使植株生长受阻，可促进植株根系增长，而且会对植株叶片形态造成影响。

图1 黄蜀葵CK 与变异株的形态特征比较

诱变后35 d，从CK 和变异株中随机各选取5 株作为样本，对其部分形态特征进行测量，结果见表3。由表3 可知，变异株的平均叶长为1.82 cm，为CK的46.7%；叶宽为2.20 cm，为CK 的53.7%；叶形指数为CK 的87.4%；株高为7.31 cm，为CK 的38.7%。经过诱变的植株叶长、叶宽、叶型指数以及株高均明显低于CK，植株生长缓慢。表明秋水仙素处理对植株作用明显，变异株具备多倍体植株的特征。

表3 黄蜀葵CK 与变异株的形态学指数差异

2.3 细胞学观察

由图2 可见，多倍体植株与正常植株不仅在形态学上具有差异，细胞学上也明显差异。正常株叶片颜色较浅，叶片下表皮气孔多而密，细胞之间有明确的界限；变异株叶片浓绿，气孔之间没有明确的细胞界限，数量少且排列松散。

图2 黄蜀葵CK 和变异株的气孔特征比较

统计固定视野下黄蜀葵CK 和变异株内气孔的个数、长度和宽度，结果见表4。由表4 可知，变异株的气孔长度和宽度均显著大于CK（P＜0.05），变异株的气孔长度为 22.81 μm，为 CK 的 1.77 倍；气孔宽度为 9.25 μm，是CK 的1.63 倍；变异株的气孔开合度比CK 的更大，叶片保卫细胞长度和宽度也均显著大于CK（P＜0.05），分别为 CK 的 1.37 倍和 1.21 倍；而气孔频度显著低于 CK（P＜0.05），为 CK 的 58.8%。变异株具有多倍体的部分特征。

表4 秋水仙素诱导黄蜀葵多倍体株系气孔形态指标比较

3 小结与讨论

药用植物多倍体根茎叶会变得巨大化、药用活性成分会变高、抗逆性和抗病性增强［28］，有利于培育新品种，提高产量［29］。秋水仙素处理也会导致植株孕性降低、生长缓慢、畸形等。因此，要获得优良的多倍体新品种，必须经过多代的选育和鉴定，方可用于生产［30］。

涂抹法和浸渍法是秋水仙素处理的常用方法［31］。李映乐等［32］用不同浓度的秋水仙素对人参果圆果组培苗进行不同时间的处理；孙长君等［33］用秋水仙素对毛酸浆露白种子进行不同时间的浸渍处理；吴青青等［34］用不同浓度的秋水仙素对百合黄精灵的组培苗鳞片进行不同时间的处理，发现秋水仙素的浓度和处理时间对植株的成活率和变异率有较大影响，与本试验结果一致。一些外界条件也会对试验结果产生显著影响，试验场所的温度、水分、营养条件等均要适宜材料的生长，在操作过程中也要尽量避免人为因素对材料造成伤害。

多倍体主要是通过自然诱导和人工诱导产生，与二倍体植株相比，多倍体一般会表现出不同的性状。吴婷等［35］采用浸泡法用秋水仙素对象鼻兰种子进行处理，四倍体植株表现出植株粗壮、根系发达等特征；张丞慧等［36］采用浸渍法用秋水仙素对新疆野苹果进行处理，得到的四倍体植株表现出叶片加厚、叶绿素含量增加、抗逆性提高等特征；李德利等［37］用浸泡法用秋水仙素对甜荞种子进行处理，多倍体甜荞植株表现出株高降低、根系粗壮、叶片表面皱缩粗糙、花器官变大等特征；杨祥波等［38］研究发现，四倍体水稻会出现分蘖变多、谷粒变长等性状。乔永刚等［39］以黄芩为试验材料，用秋水仙素处理后的植株表现出生长速度减缓、叶形指数变小等现象，并且黄芩变异株的气孔增大、数量较少。吴婷等［40］用秋水仙素处理蝴蝶兰后变异株形态和气孔特征均发生了明显变化。

秋水仙素有较强的毒性，对植株处理时间越长，死亡率就会越高，但变异率也会提高，合适的处理时间以及浓度对植物的多倍体育种至关重要。本试验采用0.1%、0.2%两个浓度的秋水仙素对黄蜀葵幼苗生长点进行涂抹，分别处理24、48、72 h，。结果表明，0.2% 浓度的秋水仙素处理48 h，成活率为48.15%，变异率92.31%，为较佳处理组合。用秋水仙素处理黄蜀葵幼苗后，变异株出现植株矮小、生长受阻、根系增长、叶片皱缩、畸形、增厚、颜色加深等现象，并且气孔和保卫细胞增大，密度减小，变异株表现出多倍体的部分性状。该结果可为黄蜀葵多倍体育种工作提供一定的参考。