西洋参果肉、果梗及籽中皂苷类成分分析

李乐，余慧，付书正，王翠竹，李平亚，2，刘金平，2，刘云鹤※

（1.吉林大学药学院，吉林 长春 130021；2.吉林大学天然药物研究中心，吉林 长春 130021）

西洋参（Panax quinquefolium L.）是五加科（Araliaceae）人参属（Panax）植物。原产于加拿大和美国，1978年开始在我国引种栽培[1,2]。《中国药典》收录的药用部位为干燥根。近年来，西洋参茎、叶、花及果实等非传统用药部位受到越来越多的关注[3-5]。研究表明，各部位中人参皂苷的组成和含量有所不同[6-8]。例如，各干燥部位中的总皂苷含量差异较大（主根4.25%，侧根4.80%，茎叶11.99%，果肉7.07%，果柄6.23%，种皮0.75%，胚乳0.06%）[6,9]。由于茎叶中总皂苷含量较丰富，“西洋参茎叶总皂苷”现已作为药品（国药准字Z20030072）应用于临床。随着地上部分的研究日益深入，西洋参果的研究也取得了较好的进展：与根部比较，果中总皂苷含量明显更为丰富[10,11]，且具有抗氧化、抗心肌缺血、抗肿瘤、降血糖和增强免疫力的作用[12-16]。作者前期首次采用LC-MS法鉴定了西洋参果梗中的小分子物质（包括三萜皂苷、甾体和酰胺等101个化学成分）[17]，结果表明与人参果梗和三七果梗相似，早期被丢弃的西洋参果梗同样富含人参皂苷[18,19]，但未进行单体皂苷的定量检测。迄今为止，文献报道了人参籽[20,21]和三七籽[21-23]的化学成分研究以及西洋参籽种皮及胚乳的总皂苷含量测定[24，25]，但未见关于西洋参籽总皂苷及单体人参皂苷含量测定的报道。文献报道已证明，新鲜药材与干燥药材在成分组成和含量上会存在一定的差异，故对新鲜西洋参果（果肉、果梗和籽）中的人参皂苷进行定量分析十分必要。

紫外-可见分光光度法（Ultraviolet-visible spectrophotometry,UV-Vis）是测定总皂苷含量的常规方法，具有专属性强、快速和准确等特点[26，27]。蒸发光散射检测器（Evaporative Light Scattering Detector,ELSD）为通用的非特异性检测器，可检测结构中无紫外吸收基团的人参皂苷类成分（例如Ocotillol型人参皂苷PF11）[28]。高效液相色谱-蒸发光散射检测器（HPLCELSD）法已广泛用于皂苷类成分的分析[29-32]。因此，为丰富西洋参果的化学成分研究，本研究首先采用UVVis法测定西洋参果各部位的总皂苷含量，继而建立HPLC-ELSD法同时测定11种单体人参皂苷含量的方法，并测定各部位的主要单体人参皂苷含量。以期为评价西洋参果中皂苷类成分提供科学数据，也为进一步开发利用西洋参果等非药用部位提供研究基础。

1 材料与方法

1.1 原料

2020年9月，于吉林省靖宇市采集3年生和4年生西洋参的新鲜带梗果实，人工剥离得到果肉、果梗和籽3个部位。西洋参果留样冻存于吉林大学天然药物研究中心。

1.2 试剂与仪器

人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rg1、Rg3、（20R）-Rg3、PF11以及三七皂苷R2对照品均为自制，经NMR、HR-LC-MS鉴定结构，并采用HPLC法测定纯度（均大于99.0%）；香草醛、高氯酸、石油醚和乙醇为分析纯，甲醇、乙腈为HPLC级；AB-8型大孔吸附树脂购于南开大学化工厂。

UV-2102C型紫外-可见分光光度计（尤尼柯仪器有限公司，上海）；Waters 1525型HPLC色谱仪（Waters公司，上海）；SEDEX 80 ELSD检测器（SEDERE，法国），CS-solution色谱工作站（岛津实验器材有限公司，上海）；XD2000A旋转蒸发仪（贤德实验仪器有限公司，上海）；W5S型恒温水浴锅（吉豫科教仪器设备有限公司，长春）；T.G.L-16aR型飞鸽超离速离心机（安亭科学仪器厂，上海）；PTX-FA210S型电子天平（华志电子科技有限公司，福建）。

1.3 总皂苷的制备

1.3.1 西洋参果肉总皂苷 精密称取新鲜西洋参果肉100 g，加入10倍体积量70%的乙醇，加热回流提取3次，每次3 h，过滤，合并滤液，减压回收至无醇味，加于AB-8大孔吸附树脂，水洗，90%的乙醇洗脱，合并醇洗脱液，减压浓缩，80℃干燥，即得[33]。

1.3.2 西洋参果梗总皂苷 精密称取新鲜西洋参果梗10 g，剪碎（长约1 cm），加入10倍体积量石油醚，室温浸泡24 h，过滤，弃去滤液，取滤渣。参照1.3.1方法，自“加入10倍体积量70%的乙醇”起依法操作。

1.3.3 西洋参籽总皂苷 精密称取新鲜西洋参籽50 g，加入10倍体积量石油醚，室温浸泡24 h，过滤，弃去滤液，取滤渣。参照1.3.1方法，自“加入10倍体积量70%的乙醇”起依法操作。

1.4 总皂苷含量的测定

1.4.1 溶液的制备

对照品溶液：精密称取人参皂苷Re对照品适量，加甲醇溶解并制成浓度为1.0 mg/mL的对照品溶液。

供试品溶液：取1.3中所制备的西洋参果肉、果梗、籽总皂苷适量，精密称定，分别加甲醇溶解并制成浓度为2.0 mg/mL的供试品溶液。

1.4.2 标准曲线的制备 精密吸取人参皂苷Re对照品溶液20L、40L、80L、120L、160L和200L，分别置于具塞试管中，低温挥去溶剂，加入1%香草醛高氯酸试液0.5 mL，置60℃恒温水浴加热15 min，立即用冰水冷却2 min，加入77%硫酸溶液5 mL，摇匀；以相应试剂作空白，参照《中国药典》2020版一部“人参总皂苷”含量测定方法[34]，在540 nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标（y），Re的量为横坐标（x）绘制标准曲线。

1.5 单体皂苷含量的测定

1.5.1色谱条件 COSMOSIL5C18-PAQ色谱柱（250mm 4.6 mm，5m），柱温：35℃；乙腈（A）水（B）为流动相，梯度洗脱程序见表1。流速：1.0 mL/min，ELSD条件为：载气N2，漂移管温度45℃，载气压力为0.3 MPa，灵敏度为10。

表1 HPLC-ELSD梯度洗脱程序Table 1 The gradient elution procedure of the HPLC-ELSD method

1.5.2 溶液的制备 对照品溶液：精密称取人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg1、Re、Rg3、（20R）-Rg3、PF11以及三七皂苷R2对照品适量，加甲醇溶解并制成浓度为0.2～0.7 mg/mL的混合对照品溶液。

供试品溶液同1.4.1中供试品溶液制备方法。

1.5.3 方法学考察

1.5.3.3 重现性试验 按照1.5.2中供试品溶液制备方法制备西洋参果肉供试品溶液6份，按照1.5.1色谱条件测定，记录色谱图，标准曲线法计算各供试品溶液中11个单体人参皂苷含量，并计算RSD值。

1.5.3.4 稳定性试验 取1.5.2中西洋参果肉供试品溶液，室温下分别放置0 h、4 h、8 h、12 h、18 h和24 h后，按照1.5.1色谱条件测定，记录色谱图，计算各单体皂苷峰面积的自然对数的RSD值。

1.5.3.5 回收率试验 取1.3中西洋参果肉样品，精密加入适量的混合对照品，按照1.5.2方法制备6份供试品溶液，根据1.5.1色谱条件测定，计算各单体皂苷的回收率（%）和RSD值。

1.5.3.6 样品含量测定 取各供试品溶液，按照1.5.1色谱条件进样20L，记录色谱图，根据标准曲线计算各供试品溶液中11个单体人参皂苷的含量，并折算成鲜果肉、果梗和籽中各单体人参皂苷的含量（%）。

2 结果与分析

2.1 总皂苷含量

测得人参皂苷Re对照品的线性回归方程为y=0.002 4x+0.014 6，相关系数r=0.999 4，说明人参皂苷Re在20～200g范围含量内线性关系良好。

含量测定结果：新鲜西洋参果肉中总皂苷平均含量为4.03%，籽中为0.36%，果梗中则为0.26%。果肉、果梗和籽中的总皂苷含量差异较大，以果肉中总皂苷含量最高，籽和果梗中总皂苷含量相近。

2.2 单体皂苷含量

2.2.1 方法学考察结果

2.2.1.1 线性关系 以各单体人参皂苷峰面积的自然对数为纵坐标（y），进样量（g）的自然对数值为横坐标（x），绘制了标准曲线，得到如下回归方程（表2）。相关系数均大于0.999 7，结果表明，该11个单体人参皂苷在范围内线性关系良好。

表2 11种单体人参皂苷的线性回归方程、相关系数和线性范围Table 2 The linear regression equation，correlation coefficients and linear ranges of 11 kinds of monomer ginsenosides

2.2.1.2 精密度试验 连续5次进样混合对照品溶液中，各单体人参皂苷峰面积自然对数的RSD值分别为1.83%、1.75%、1.67%、1.72%、1.59%、2.12%、1.85%、1.47%、1.62%、1.97%和1.54%，均小于3%，表明仪器精密度良好。

2.2.1.3重现性试验 6份西洋参果肉供试品溶液测定结果中，各单体人参皂苷含量的RSD值分别为1.57%、0.97%、1.54%、1.35%、1.75%、1.53%、1.84%、1.76%、1.59%、2.12%和1.94%，均小于3%，表明方法的重现性良好。

2.2.1.4稳定性试验 西洋参果肉供试品溶液室温放置24 h后，各单体人参皂苷峰面积自然对数的RSD值分别为1.75%、2.15%、1.78%、2.07%、2.09%、1.84%、1.76%、1.94%、1.67%、1.44%和1.59%，均小于3%，表明西洋参果肉供试品溶液室温放置24 h内稳定。

2.2.1.5回收率试验 6份西洋参果肉供试品溶液中11种单体人参皂苷的平均回收率分别为96.82%、98.35%、95.97%、96.65%、97.65%、100.25%、101.35%、99.34%、97.59%、100.44%和97.66%，平均回收率为96.82%～101.35%；RSD值分别为2.33%、1.64%、0.97%、1.35%、1.75%、1.44%、1.87%、1.55%、2.11%、2.29%和1.94%，均小于3%。结果表明该方法回收率较高，准确度良好。

2.2.2 样品含量测定 混合对照品溶液以及西洋参果肉、果梗、籽供试品溶液的典型色谱图见图1。从混合对照品溶液色谱图中可见，80 min内，11个单体皂苷均可检出，且分离度良好。

图1 混和对照品溶液（A）、西洋参果肉（B）、果梗（C）以及籽供试品溶液（D）的HPLC-ELSD图Fig.1 HPLC-ELSD chromatograms of mixed reference substance solution(A)，American ginseng berry(B)，stem(C)，and seed(D)test solutions

以标准曲线法计算各供试品溶液中11个单体皂苷成分的含量，并折算成鲜果肉、果梗、籽中的各单体人参皂苷的含量（%），结果见表3，可知3个部位中单体皂苷种类很相似，但含量却存在较大差异：新鲜西洋参果肉中含有较多的人参皂苷Rb3（0.98%）、Rg3（0.60%）和PF11（0.45%），果梗中则含有较多的人参皂苷Re（0.04%）、（20R）-Rg3（0.04%）和Rb3（0.03%），而籽中则含有较多的人参皂苷Rb3（0.10%）、PF11（0.04%）和Rb1（0.03%）。

表3 鲜西洋参果肉、果梗以及籽中主要单体皂苷含量Table 3 Contents of main monomer saponins in the fresh berry，stem and seed of American ginseng

3 讨论

总皂苷研究结果表明，新鲜西洋参果肉、果梗和籽中均含有人参皂苷，西洋参果肉中总皂苷含量最为丰富（4.03%），其次是籽（0.36%）、果梗（0.26%）。与文献报道比较，西洋参果肉中总皂苷含量高于西洋参主根中总皂苷含量（3.43%）[35]。

单体皂苷研究结果表明，所建立的11种皂苷同时测定的方法简单、可行，为人参皂苷的同时测定提供参考。分析结果证明，西洋参果梗、籽中人参皂苷的种类与西洋参果肉相似，但含量存在差异：果梗中Re（0.04%）、Rb3（0.03%）和（20R）-Rg3（0.04%）含量较高，而籽中则含有较多的PF11（0.04%）、Rb1（0.03%）和Rb3（0.10%）。与文献报道比较，人参皂苷PF11（0.45%）、Rb3（0.98%）和Rg3（0.60%）在西洋参果肉中的含量高于西洋参根和茎叶，且西洋参果肉中人参皂苷Rb3的含量高于在西洋参根中的含量（0.55%）[32]。此外，西洋参果的HPLC-ELSD谱图上尚存在一些未鉴定的色谱峰，在将来的研究中将进行进一步地分离提取和鉴定。

以上研究说明西洋参果是宝贵的人参皂苷来源。籽常用于栽培，但果梗和果肉都应该得到更充分的合理利用。本研究填补了新鲜西洋参果肉、果梗、籽总皂苷以及单体人参皂苷研究的空白，为丰富和进一步评价西洋参果的化学组成提供了科学数据，也为进一步开发利用西洋参果这一非药用部位提供研究基础。