降解玉米秸秆放线菌的筛选及发酵工艺优化

刘晓飞 ,侯 艳, 郑志辉 ,马京求, 戚月娜, 郝 冬

(哈尔滨商业大学 食品工程学院，哈尔滨 150028)

伴随着时代的创新与开拓，可循环利用的生物质能源已成为国内外学者关注的重点问题[1].在中国，农作物秸秆是最为丰富的农业废弃物之一，同时也是最为丰富的可再生资源之一，年总产量约为8×109t[2].其主要构成成分木质纤维素已被认可为环境友好、取之不尽的原材料能源[3].但由于处理方式不当造成极大的资源浪费以及环境问题，秸秆的复杂结构和成分也导致了其难以降解利用[4].而物理、化学、生物法因其自身优势被认为是有效处理秸秆的方法[5].GUO H[6]等人用物理法使秸秆中纤维素降解了17.76%.且比较了物理、化学和微生物法处理玉米秸秆，发现微生物法降解秸秆后会最大程度地保留玉米秸秆中的营养成分.WANG P[7]等用化学法处理秸秆，发现三种木质纤维素材料的降解率均有所提高，纤维素提高了40.08%、半纤维素提高了45.71%、木质素提高了52.01%.WEI Y[8]等人将嗜热放线菌接种在小麦、大豆、玉米和水稻秸秆中，结果表明，接种放线菌后不仅改变了原有菌群群落的结构，且可使秸秆内部结构发生改变.PEI-PEI LI[9]等人创建了一种微生物降解体系ADS-3，该体系的酶活可达0.15 U/mL，表明该体系可对纤维素进行降解.目前，物理化学法处理秸秆成本高、反应不完全、易造成二次污染，且依然改变不了纤维素降解率低下的问题，而生物法具有反应条件温和、投资小、成本低、无污染等优点，经过对比并综合考虑为最佳的解决途径.

本实验已在寒地土壤中筛选出一株放线菌CPA-3-4，而该菌具有高效降解纤维素的能力.在研究中以秸秆为底物进行微生物发酵，采用单因素、响应面优化秸秆的发酵条件，从而确定最优条件.在最优条件下，采用范式洗涤法测定发酵前后秸秆中主要成分的变化情况，通过扫描电镜、傅里叶红外光谱对发酵前后秸秆进行结构表征，可知CPA-3-4对纤维素的降解能力，为研究微生物降解秸秆提供创新思路.

1 实验材料和方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

样品：土壤、玉米秸秆.

上述两种样品由黑龙江省牡丹江市获得(东经128°02′、北纬43°24′).

1.1.2 仪器与设备

见表1.

表1 仪器与设备

1.1.3 培养基制备

CPA固体培养基：纤维素0.25%，MgSO40.02%，丙酮酸钠0.2%，CaCl20.05%，脯氨酸0.1%，K2HPO40.02%，KNO30.025%，FeSO40.001%，琼脂2%，pH 7.2～7.4.

ISP3固体培养基：燕麦片2%，MgSO40.02%，KNO30.02%，K2HPO40.05%，琼脂2%，pH 7.2～7.4.

CMC-Na培养基：CMC-Na 1.5%，酵母膏0.1%，NH4NO30.1%，MgSO4·7H2O 0.02%，K2HPO40.05%，pH 7.2～7.4.

GY液体培养基：酵母浸粉1%，葡萄糖1%，MgSO40.05%，K2HPO40.05%，pH 7.2～7.4.

发酵培养基：玉米秸秆2 g，(NH4)2SO40.4%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.05%，蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，pH 7.2～7.4.

1.2 方法

1.2.1 放线菌的初筛

土样经自然风干后，用酒精灼烧后的研钵研磨，取5 g于100 mL锥形瓶，称取45 mL无菌水加入后封口，在28 ℃，180 r/min的条件下震荡1 h，经过滤即是10-1原液，为得到浓度为10-3、10-4、10-5的样品，将其进行稀释处理，分别取稀释后的菌液200 μL，于CPA培养基上进行涂布处理，于28 ℃条件下进行倒置培养，15 d后将培养基中生长的放线菌挑至ISP3固体培养基上，进行单菌落筛选，直到得到单一菌落便可进行传代培养.

1.2.2 放线菌的复筛

CMC-Na培养基被用于鉴定筛选出的单一菌落，将菌落点至培养基中在28 ℃下恒温倒置培养7 d，配制1 g/L刚果红溶液注入平板中，30 min后，1 mol/L NaCl溶液洗脱30 min，将每一个单菌落进行测量处理、并记录其透明圈的直径D与菌落生长的直径d.

1.2.3 纤维素酶活力的测定

菌株的纤维素酶酶活的测定，参照文献[10]的方法.葡萄糖标准曲线进行绘制，并在540 nm波长处分别测定菌株的四种酶活力：滤纸酶活力(FPA)、外切葡聚糖酶活力(C1)、内切葡聚糖酶活力(Cx)和β-葡萄糖苷酶酶活力.

1.2.4 菌种鉴定

1)形态学观察

将所筛的菌株接在ISP3培养基上经过28 ℃恒温培养7 d后，进行菌株的形态学观察；经观察后将菌株接种于GY培养基并经过28 ℃，180 r/min培养7 d，取适量菌体置于载玻片上，将菌体用番红溶液处理，利用显微镜镜检观察其微观结构.

2)分子生物学鉴定

提取所筛菌株的DNA可参照文献[11]，PCR扩增其16S rRNA序列，连接载体pMD18-T后，转入Top10感受态细胞，选取阳性克隆重组子，送至检测机构测序，测序结果在Ez Bio Cloud(http://eztaxon-e.ezbiocloud.net)数据库分析对比序列的相似性，用临近法构建菌株的系统发育树.

1.2.5 玉米秸秆降解率的测定

利用失重法[12]对玉米秸秆进行降解率(Y)的测定.具体计算公式如下：

Y=(m-m1)/m×100%

其中:Y为秸秆降解率；m为培养基中秸秆粉末质量；m1为降解后秸秆粉末质量.

1.2.6 单因素实验

以Y为指标，探究发酵天数(1、3、5、7、9 d)、培养基初始pH值(4、5、6、7、8)、发酵转速(140 、160 、180 、200、220 r/min)、发酵温度(24、26、28、30、32 ℃)及接菌量(1%、2%、3%、4%、5%)对Y的影响，按上述单因素依次进行实验，且后续单因素实验均在前一因素实验的较优结果上进行.

1.2.7 玉米秸秆发酵条件的优化

利用软件Design-Expert version8.0.6响应面法优化秸秆的降解条件.选择对纤维素降解率影响较大的因素为影响因素，以秸秆降解率(Y)为响应值，对培养条件进行优化.通过方差分析以及检验回归方程中各项影响及显著性水平.利用等高线图，分析影响因子间的相互作用以及对Y的影响，在一定范围内得出最优发酵条件及降解率，并进行发酵验证.

1.2.8 玉米秸秆中主要成分的测定

测定发酵前与最优条件下发酵后的秸秆中纤维素、半纤维素、木质素及灰分各组分的含量采用范式洗涤法[13].

1.2.9 玉米秸秆扫描电镜结构观察

1.2.10 玉米秸秆红外光谱分析

参照文献[15]处理秸秆，对发酵前与最优条件下发酵后的玉米秸秆进行红外光谱扫描观察.

2 实验结果与讨论

2.1 刚果红染色菌株CPA-3-4的鉴定结果

菌株CPA-3刚果红鉴定结果如图1所示.

图1 菌株CPA-3-4刚果红染色结果

如图1所示可知，其中刚果红染色透明圈直径(D)与菌落生长直径(d)分别为(22.90±5.48)mm和(4.50±0.57) mm，CPA-3-4的透明圈与菌落的比值为D/d=5.02±0.75.该结果表示CPA-3-4具备较好的纤维素降解效果.

2.2 菌株CPA-3-4纤维素酶活力测定结果

1)葡萄糖标准曲线的绘制

测得的葡萄糖标准曲线如图2所示.

图2 葡萄糖标准曲线

图2所示葡萄糖标准曲线的绘制可利用origin 8.0，该曲线的回归方程为Y=1.1214x-0.117 9，R2=0.998 49，拟合度较好.

2)酶活测定结果

从现在以至未来，人类社会已然进入“一切皆可编程、万物均要互联”的时代，面对人工智能以及数据开放造成的物理和人身伤害，360集团发布了“360安全大脑-分布式智能网络安全防御系统”，系统汇聚了360十余年的海量数据和4000多项大数据与人工智能专利技术，构建起一个集感知、学习、推理、预测以及决策于一体的智能防御系统，为基础设施安全、社会安全、城市安全以及个人安全保驾护航。

经测定菌株CPA-3-4四种酶FPA、C1、CX和β-糖苷酶酶活分别为：(11.90±0.45) U/mL、(12.42±1.07) U/mL、(30.34±1.02) U/mL和(29.27±0.43) U/mL，结果表明，纤维素酶可由菌株CPA-3-4产生，且拥有降解纤维素的作用，与刚果红染色鉴定结果是一致的.且与PEI-PEI LI[9]等人创建的微生物体系ADS-3纤维素酶酶活最高可达0.15 U/mL相比，由菌株CPA-3-4产生的纤维素酶活是较高的.

2.3 菌种鉴定结果

2.3.1 菌株CPA-3-4形态观察结果

菌株CPA-3-4形态观察结果如图3、4所示.

图3 单菌落形态图

图3所示为菌株CPA-3-4在ISP3培养基的生长形态，可以看出CPA-3-4产生白色孢子及乳白色基内.图4镜检图可明显看出CPA-3-4菌丝形态，说明CPA-3-4具有典型的放线菌特征.

图4 番红染色镜检图

2.3.2 分子鉴定结果

菌株CPA-3-4绘出的系统发育树结果如图5所示.

图5 菌株系统发育树

经鉴定CPA-3-4的16S rRNA序列共1 518 bp，图5所示，菌株CPA-3-4与菌株StreptomycesrishiriensisNBRC 13407T的16S rRNA序列同源性最高可达99.52%，二者形成一个单独且稳定的分支，链霉菌属与菌株CPA-3-4同源性较高，可确定菌株CPA-3-4属于链霉菌属.

2.4 单因素实验结果分析

2.4.1 发酵天数

发酵天数对玉米秸秆降解率(Y)的影响如图6所示.

图6 发酵天数对玉米秸秆降解率(Y)的影响

如图6所示可知如下结论，发酵天数的增加，Y值逐渐增大，在培养第7天处达到最高值为17.835%，7 d后Y值下降.这可能是由于随着天数的延长，菌株CPA-3-4繁殖数量增加，发酵作用增强，降解作用也随之增强，7 d后CPA-3-4产酶活力下降，或经代谢后体系内产生大量二氧化碳，造成氧气量不足，菌种死亡率上升，致使玉米秸秆降解率下降.

2.4.2 培养基初始pH

培养基初始pH对玉米秸秆降解率(Y)的影响如图7所示.

图7 培养基初始pH对玉米秸秆降解率(Y)的影响

图7所示，随着培养基初始pH逐渐增大，Y值表现出先上升后下降的趋势，在pH=7时降解率最高，为18.895%.这可能是因为菌株CPA-3-4在pH范围4～8都可生长，但pH 7是其最适生长pH，在此pH条件下CPA-3-4代谢作用最强，因此玉米秸秆降解率也最大.

2.4.3 发酵转速

发酵转速对玉米秸秆降解率(Y)的影响如图8所示.

图8所示，随着发酵转速的增加Y值呈现增大先上升后下降的趋势，且在转数处于180 r/min处时达到最大值20.565%.可能是由于随着转速的不断增大，降解体系内的溶氧量也会随之增大[16]，降解效率变高是因为菌株CPA-3-4的代谢与发酵作用增强，然而，当转数超过180 r/min时，由于转速过高致使菌体破裂死亡，致使Y值下降.

图8 发酵转速对玉米秸秆降解率(Y)的影响

2.4.4 发酵温度

发酵温度对玉米秸秆降解率(Y)的影响如图9所示.

图9 发酵温度对玉米秸秆降解率(Y)的影响

图9所示，玉米秸秆降解率随着发酵温度不断上升，先升高后下降，当温度为28 ℃时降解率最高，为21.915%.这可能是由于温度影响着降解过程中的pH变化[17]，且28 ℃为菌株CPA-3-4的最适生长温度，CPA-3-4在此温度下培养可出现生长繁殖旺盛的状态，降解作用也达到高峰.

2.4.5 接菌量

接菌量对玉米秸秆降解率(Y)的影响如图10所示.

图10所示，当接菌量4%时Y值最高，为22.814%.接菌量在1%～4%范围时，Y值显著增高，这是由于随着CPA-3-4菌量的增加，其代谢作用增强即其所产的纤维素酶量增加，当接菌量超出4%后，由于菌浓度过高，菌种死亡造成降解率下降的原因可能是体系内的营养物质及溶氧量不足以支撑菌种生长.

图10 接菌量对玉米秸秆降解率(Y)的影响

2.5 响应曲面优化

根据单因素实验结果，可选取作为响应面的影响因素有四种分别为：培养基初始pH(A)、发酵转速(B)、发酵温度(C)、接菌量(D)，根据Box-Behnken实验原理设计响应曲面的因素水平表，如表2所示.利用软件Design-Expertversion 8.0.6，对表3中所得数据进行了多元回归拟合，求得降解率与各因素的回归方程，公式如下.

表2 响应曲面因素水平表

表3 响应曲面实验结果

降解率(Y)=28.15 + 0.51A + 1.44B + 0.44C + 0.73D - 0.29AB - 0.42AC + 0.14AD - 0.062BC + 0.46BD + 1.18CD - 3.74A2- 3.64B2- 2.28C2- 5.37D2

对所得数据进行方差分析和显著性检验，如表4所示.

由以上结果分析可知：此响应模型的P<0.000 1，表明该回归方程极其显著，且与各个单因素之间的关系也是极其显著的；而其失拟项结果为P=0.347 2>0.05，说明其差异性是不显著的.由此可表明该模型拟合度较好，可用于优化玉米秸秆降解实验.得到的等高线图与3D效果图如图11～13所示.

图12 发酵转速、接菌量对玉米秸秆降解率影响的等高线及响应曲面

图13 发酵温度和接菌量对玉米秸秆降解率影响等高线及响应曲面

综合以上单因素和响应曲面分析结果，使用Design-Expertversion 8.0.6进行响应值的最优条件选择，得出最优的工艺参数是：培养基初始pH 7.06，发酵转速184 r/min，发酵温度28.22℃，接菌量4.09%，在此工艺参数下预测的Y值为28.363 8%.考虑实验的实际情况，确定4个因素的值为：培养基初始pH 7，发酵转速180 r/min，发酵温度28 ℃，接菌量4%.在此条件下重复试验得到Y值为28.36%，与预测Y值相差不大.

2.6 玉米秸秆中成分测定结果

玉米秸秆降解前后主要成分测定结果见表5.

表5 玉米秸秆降解前后成分测定结果

由表5内数据可以看出，秸秆经菌株CPA-3-4降解后，其内部的纤维素、半纤维素、木质素含量均有所下降，说明CPA-3-4对纤维素、半纤维素、木质素均具备一定的降解效果，降解率分别为39.99%、22.25%、26.87%.

2.7 玉米秸秆扫描电镜观察结果

采用扫描电镜(SEM)观察玉米秸秆降解前后的表面组织结构变化，结果见图14、15.

图14 降解前玉米秸秆表面组织结构

图15 降解后玉米秸秆表面组织结构

图14、15可知，降解前玉米秸秆表面组织的结构排布紧密，呈长条状.接种菌株CPA-3-4降解后，玉米秸秆表面组织结构有明显裂解、塌陷现象，且出现了许多孔洞.说明菌株CPA-3-4具有良好的降解纤维素的效果.

2.8 玉米秸秆红外光谱分析结果

玉米秸秆降解前后红外光谱结果见图16.

图16 玉米秸秆降解前后红外光谱分析

3 讨 论

秸秆是农业废弃物之一，也是世界公认的重要的生物质资源之一，近年来微生物法降解秸秆已成为许多研究人员的侧重方向[20].冯红梅等[21]从高温期堆肥样品中筛出6株可高效降解纤维素的菌株，并将其复配成混合菌群，并对该菌群优化最佳产酶条件，最优条件下该菌群最高酶活可达135.9 U/mL.GUOXIANG Z等[22]通过连续富集培养，获得了一种木质纤维素降解微生物群落LTF-27.该菌落可有效的分解稻草中的木质纤维素材料.XIUJIE G等[23]从低温秸秆腐殖质中筛选出3株高效降解菌，构建原位降解菌系，单因素结合响应面优化该菌系最优降解秸秆的条件.最优条件下，玉米秸秆平均失重率为60.55%.秸秆中存在许多的的氮、磷、钾等农作物必须的微量元素，降解还田后不仅可增加土壤的养分，还可以增强土壤中转化酶活力，使有机磷转化为无机磷，更利于农作物吸收[24].本实验筛选分离得到的菌株CPA-3-4纤维素的降解能力虽不及复合菌系，但也可为秸秆还田等提供理论参考，也可将其驯化提高其产纤维素酶的能力或与其他菌株复配成复合菌系用于秸秆的降解.

4 结 语

本实验筛选分离得到一株能够降解纤维素的菌株，命名为CPA-3-4，经16S rRNA分子鉴定确定其为链霉菌属.经实验验证其具备较好降解纤维素的效果.在最优条件下接种CPA-3-4进行玉米秸秆的降解，降解率为28.36%.本文探究了菌株CPA-3-4降解纤维素的能力，以期单一或复配发酵秸秆后直接还田或与矿物肥料结合用作复合肥料，用以减小土壤破坏以及增强土壤肥力.