海马参与雌激素加重咬合干扰致去卵巢大鼠慢性咬肌痛敏

范莹莹，刘 云，曹 烨，谢秋菲

(北京大学口腔医学院·口腔医院修复科，国家口腔医学中心，国家口腔疾病临床医学研究中心，口腔数字化医疗技术和材料国家工程实验室，口腔数字医学北京市重点实验室，国家卫生健康委员会口腔医学计算机应用工程技术研究中心，国家药品监督管理局口腔生物材料重点实验室，北京 100081)

临床研究和动物实验的结果证实咬合改变可以引起咀嚼肌疼痛[1]。多项调查研究显示，口颌面疼痛、头痛、内脏痛等不同类型的慢性疼痛都具有明显的性别差异，表现为女性较男性患病率高，对疼痛更为敏感[2-3]。咀嚼肌疼痛也表现为女性患者居多[4-5]，症状表现较男性严重[6]。Cao等[7]在大鼠右上第一磨牙粘固0.4 mm金属冠模拟临床上咬合干扰导致的慢性咀嚼肌痛敏，Liu等[8]在实验性咬合干扰(experimental occlusal interference，EOI)模型的行为学研究中发现雌性大鼠较雄性更易痛敏。Niu等[9]发现在咀嚼肌炎性痛模型中，雌性大鼠较雄性大鼠的急性咀嚼肌痛敏反应更为强烈，Cairns等[10]研究显示雌性大鼠咬肌痛觉初级传入神经的兴奋性和下颌肌电图反射性活动明显大于雄性大鼠。

海马是与学习和记忆密切相关的重要的脑部结构，也参与疼痛的调控。临床试验研究发现纤维肌痛症患者的海马代谢产物的异常改变[11]，通过对腰痛患者进行血氧水平依赖性功能磁共振脑功能成像，发现了海马的活跃变化[12]。动物实验研究也显示疼痛的感受伴随着海马局部血流量的变化[13-14]，炎性刺激诱发的疼痛会引起海马内c-fos表达的变化等[15]。海马具有丰富的雌激素受体β(estrogen receptors β, ERβ)[16-17]，雌激素在海马突触可塑性的调节中发挥重要作用[18]，疼痛状态下对受试者进行脑功能磁共振成像发现海马区域信号变化的差异[19]，提示海马可能在疼痛的性别差异中起重要作用。在对内脏痛觉超敏大鼠模型功能磁共振成像研究中，Hubbard等[20]发现17β-雌二醇(17β-estradiol，E2)引起大鼠海马功能活动改变。Jie等[21]曾构建雌鼠炎性咬肌疼痛模型，发现海马中的细胞外信号调节激酶(extracellular signal regulated kinase1/2，ERK1/2)磷酸化(phospho-ERK1/2，p-ERK1/2)参与了雌鼠的急性咬肌痛敏。Liverman等[22]研究发现，与单纯完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant，CFA)引起的咬肌炎性痛相比，E2通过上调三叉神经节中p-ERK1/2的表达，增加大鼠CFA注射后的痛敏程度。

本课题组前期研究EOI导致慢性咬肌痛敏时，发现三叉神经脊束核内ERK1/2的磷酸化，后续研究发现了痛敏的性别差异及外周神经系统三叉神经节瞬时受体电位香草酸亚型1(transient receptor potential vanilloid 1，TRPV1)参与E2剂量依赖性加重慢性咬肌痛敏。然而，E2影响EOI所导致的慢性咀嚼肌痛敏的中枢机制尚不清楚，根据急性咬肌痛敏中海马内ERK1/2通路被激活等前期研究结果，推测慢性咬肌痛敏的中枢机制可能与海马ERK1/2通路的激活相关，故本研究拟进一步探究海马内ERK1/2的磷酸化在E2影响 EOI诱发的慢性咬肌痛敏中的作用。

1 资料与方法

1.1 实验动物

雌性Sprague Dawley(SD)大鼠32只，初始体质量200～220 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。大鼠饲养于温度为23℃±2℃、恒温、恒湿的SPF级动物房。饲养条件为12 h循环昼夜交替照明，自由饮水、饮食。所有动物饲养及动物实验均获得北京大学生物医学伦理委员会实验动物福利伦理分会批准(批准号： LA2017129)。雌性SD大鼠进行双侧卵巢摘除手术(ovariectomy，OVX)后被随机分为4组(每组8只)，对照组： OVX组，于OVX术后7 d开始0 μg/d E2(即溶剂vehicle替代)，不施加EOI；实验组：(1)OVX+E2组，于OVX术后7 d开始80 μg/d E2替代，不施加EOI；(2)OVX+EOI组，于OVX术后7 d开始0 μg/d E2替代，术后17 d施加EOI；(3)OVX+E2+EOI组，于OVX术后7 d开始80 μg/d E2替代，术后17 d施加EOI。

1.2 OVX及E2替代

给大鼠腹腔注射1%(质量分数)戊巴比妥钠(40～50 mg/kg)麻醉，于背部双侧做纵行切口打开腹腔，找出并结扎输卵管，摘除卵巢。OVX术后恢复7 d后，OVX+E2组和OVX+E2+EOI组每日颈部皮下注射80 μg E2[体积200 μL，溶于4%(体积分数)乙醇，Sigma公司，美国]， 对照组和OVX+EOI组每日颈部皮下注射0 μg/d E2(用溶剂vehicle替代)， 直至实验结束。

1.3 大鼠EOI模型的建立

在第17天(E2替代10 d)， 参考Cao等[7]实验方法，大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，使用树脂粘接剂(Panaiva F，Kuraray公司，日本)在右侧上颌第一磨牙粘固0.4 mm厚度的金属全冠。

1.4 大鼠咬肌机械刺激反应阈值的测定

大鼠于OVX术前4～6 d熟悉环境，测试者每日安抚大鼠15 min。正式测试时，安抚大鼠达放松状态倚靠在实验者手中，实验者另一手持电子测痛仪(Bioseb公司，法国)， 电子测痛仪安装改良的直径3 mm的硅橡胶圆钝测试头，使测试头垂直咬肌匀速施压，待大鼠产生逃避、尖叫或缩头反应时立即停止施压，记录测痛仪读数。分别于OVX术前1～3 d，术后7 d(E2替代开始)、术后17 d(E2替代10 d，即EOI开始)、术后24 d(EOI 7 d)每天固定时间测定大鼠双侧咬肌机械刺激反应阈值，双侧各重复测试5次，每次间隔1 min，测试时间点见图1。

OVX, ovariectomy; EOI, experimental occlusal interference; E2, 17β-estradiol; the day of OVX was taken as day 0.图1 实验流程图Figure 1 Experimental flow chart

1.5 Western Blot

第24天(EOI 7 d)大鼠在2%(质量分数)戊巴比妥钠过量麻醉下断头处死，于冰上将大脑沿中线切开，迅速剥离双侧海马分别放入离心管，各加入1 mL 裂解液、10 μL蛋白酶抑制剂、10 μL磷酸酶抑制剂，使用预冷组织破碎仪匀浆约1.5 min，静置15 min后4 ℃条件下13 000×g离心15 min取上清。随即测其蛋白浓度并制备30 μg /10 μL蛋白上样体系，100 ℃水浴5 min使蛋白变性。于80 V、20 min和100 V、1 h条件下进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，4 ℃、200 mA恒流条件下80 min将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上。用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐溶液+吐温(Tris-HCl+Tween，TBST)洗涤，5%(质量分数)牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)室温封闭，于4 ℃过夜孵育兔源p-ERK1/2(1 ∶2 000，Cell Signaling Technology公司，美国)一抗，次日TBST洗涤后室温孵育辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记的羊抗兔(1 ∶10 000，中杉金桥公司，中国)二抗1 h，TBST洗涤后用增强型化学发光试剂(enhanced chemiluminescence， ECL)室温孵育2 min，放在凝胶成像系统中曝光拍照。PVDF膜置于Stripping缓冲液中室温孵育30 min后，重复上述洗涤、封闭等步骤，依次孵育兔源ERK1/2(1 ∶2 000，Cell Signaling Technology公司，美国)一抗、鼠源GAPDH(1 ∶2 000，华兴博创公司，中国)一抗并显影拍照，使用Image J 1.38 软件分析条带光密度值。

1.6 免疫荧光染色

第24天(EOI 7 d)大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠过量麻醉下行左心室灌流，先用0.9%(质量分数)生理盐水，后用4%(质量分数)多聚甲醛。取双侧海马置于4%多聚甲醛中4 ℃过夜固定，20%(体积分数)蔗糖4 ℃、24 h和30%(体积分数)蔗糖4 ℃、24 h脱水。-20 ℃冰冻切片，厚度15 μm，每5张切片取1张进行p-ERK1/2免疫荧光染色，每侧海马取5张切片。磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)洗片，10%(体积分数)羊血清封闭液(中杉金桥公司，中国)室温封闭60 min，兔源p-ERK1/2一抗(1 ∶200，Cell Signaling Technology公司，美国)、鼠源神经元特异核蛋白(NeuN)(1 ∶500，Abcam公司，英国)一抗4 ℃孵育过夜，PBS洗片，四甲基异硫氰酸罗丹明(tetraethyl rhodamine isothiocyanate，TRITC)-羊抗兔二抗(1 ∶200，中杉金桥公司，中国)、异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)-羊抗小鼠二抗(1 ∶200，中杉金桥公司，中国)室温孵育90 min，洗片，荧光封片剂(中杉金桥公司，中国)封片，于荧光显微镜下观察计数FITC与TRITC双重标记的细胞。

1.7 统计学分析

使用SPSS 24.0进行统计分析，实验数据以均数±标准误表示。对每组不同时间点机械刺激反应阈值进行单因素方差分析，每组每个时间点左侧咬肌与右侧咬肌的机械刺激反应阈值进行配对t检验。对第24天(EOI 7 d)行为学结果进行双因素方差分析，使用Bonferroni法进行后检验；对海马内p-ERK1/2表达量的变化采用双因素方差分析，使用Bonferroni法进行后检验。所有检验均采用双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 OVX大鼠双侧咬肌机械刺激反应阈值

各组大鼠双侧咬肌机械刺激反应阈值情况见表1。OVX术后大鼠双侧咬肌机械刺激反应阈值较基线升高，OVX+E2组和OVX+E2+EOI组第17天(用E2替代10 d)大鼠双侧咬肌机械刺激反应阈值较第7天(OVX 7 d)显著降低(P<0.01)， OVX+EOI组第17天(用溶剂vehicle替代10 d)大鼠双侧咬肌机械刺激反应阈值较第7天(OVX 7 d)无明显变化(P>0.05)。OVX+EOI组和OVX+E2+EOI组第24天(EOI 7 d)大鼠双侧咬肌机械刺激反应阈值较第17天显著降低(P<0.01)，OVX+E2组第24天较第17天差异无统计学意义(P>0.05)，左、右侧咬肌机械刺激反应阈值差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组大鼠左右侧咬肌机械刺激反应阈值比较(n=8)Table 1 Comparison of head withdrawal threshold (HWT) between left and right bilateral masseters in each group (n=8)

第24天(EOI 7 d)各组右侧咬肌机械刺激反应阈值的双因素方差分析结果显示，E2(F=35.268)和EOI(F=231.675)对阈值有显著影响(P<0.01)，E2和EOI的交互作用显著(F=7.050，P<0.05)。各组间两两比较发现，组间差异有统计学意义(P<0.05)。左侧咬肌机械刺激反应阈值的双因素方差分析结果与右侧基本一致，E2(F=20.071)和EOI(F=127.291)对阈值有显著影响(P<0.01)， E2和EOI的交互作用显著(F=5.433，P<0.05)。各组间两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2 OVX大鼠双侧海马CA3区的p-ERK1/2与神经元免疫荧光染色共定位

大鼠双侧海马CA3区存在p-ERK1/2的表达，且与神经元共定位，见图2、3。双因素方差分析结果显示，右侧E2与EOI两个因素对p-ERK1/2阳性神经元比例均有显著影响(E2：F=68.23，P<0.001；EOI：F=321.1，P<0.001)，两者交互作用不显著。各组间两两比较发现，对照组、OVX+E2组、OVX+EOI组和OVX+E2+EOI组p-ERK1/2阳性神经元比例依次增高，且组间差异有统计学意义(P<0.05)。左侧结果与右侧基本一致：E2与EOI两个因素对p-ERK1/2阳性神经元比例均有显著影响(E2：F=49.008，P<0.001；EOI：F=169.3，P<0.001)， 两者交互作用不显著；各组间两两比较差异有统计学意义(P<0.05)。

OVX, ovariectomy; EOI, experimental occlusal interference; E2, 17β-estradiol; p-ERK1/2, phospho-extracellular signal regulated kinase1/2. The arrows indicate p-ERK1/2 (red) and NeuN (green) double-labeled neurons. * P<0.05， OVX compares with the other three groups；# P<0.05，OVX+E2 compares with the other three groups；△ P<0.05，OVX+EOI compares with the other three groups；▲ P<0.05，OVX+E2+EOI compares with the other three groups.图2 第24天(EOI 7 d)左侧海马CA3区p-ERK1/2和神经元共定位(n=3，免疫荧光显微镜)Figure 2 Colocalization of p-ERK1/2 with NeuN in CA3 of the left hippocampus at day 24 (day 7 following placement of occlusal interference, n=3, immunofluorescence microscopy)

OVX, ovariectomy; EOI, experimental occlusal interference; E2, 17β-estradiol; p-ERK1/2, phospho-extracellular signal regulated kinase1/2. The arrows indicate p-ERK1/2 (red) and NeuN (green) double-labeled neurons. * P<0.05， OVX compares with the other three groups；# P<0.05，OVX+E2 compares with the other three groups；△ P<0.05，OVX+EOI compares with the other three groups；▲ P<0.05，OVX+E2+EOI compares with the other three groups.图3 第24天(EOI 7 d)右侧海马CA3区p-ERK1/2和神经元共定位(n=3，免疫荧光显微镜)Figure 3 Colocalization of p-ERK1/2 with NeuN in CA3 of the right hippocampus at day 24 (day 7 following placement of occlusal interference, n=3, immunofluorescence microscopy)

2.3 Western Blot 检测OVX大鼠双侧海马p-ERK1/2蛋白表达情况

大鼠双侧海马p-ERK1/2蛋白表达量见图4。双因素方差分析结果显示，右侧E2与EOI两个因素对p-ERK1/2表达比例均有显著影响(E2：F=8.901，P=0.009；EOI：F=22.775，P<0.001)， 两者交互作用不显著。两两比较结果显示，对照组、OVX+E2组和OVX+EOI组表达量依次增高，组间差异无统计学意义(P>0.05)，OVX+E2+EOI组p-ERK1/2表达量显著大于其他3组(P<0.05)。左侧结果与右侧基本一致：E2与EOI两个因素对p-ERK1/2表达比例均有显著影响(E2：F=11.853，P=0.004；EOI：F=8.142，P=0.013)，两者交互作用不显著；OVX+E2+EOI组p-ERK1/2表达量显著大于其他3组(P<0.05)。

* P<0.05; OVX, ovariectomy; EOI, experimental occlusal interference; E2, 17β-estradiol; p-ERK1/2, phospho-extracellular signal regulated kinase1/2; ERK1/2, extracellular signal regulated kinase1/2; GAPDH, glyceraldehyde 3-phosphate ehydrogenase.图4 第24天(EOI 7 d)海马p-ERK1/2表达量的变化(n=5)Figure 4 Change of p-ERK1/2 level in hippocampus at day 24 (day 7 following placement of occlusal interference, n=5)

3 讨论

慢性疼痛是世界公认的治疗难题，长期存在的疼痛感受严重影响患者的生活质量和身心健康，因此探索慢性疼痛的机制并寻找治疗靶点具有重要意义。疼痛与学习、记忆在突触可塑性方面有惊人的相似之处[23]，前脑是脑的最重要、最复杂的部分，海马作为前脑的脑区之一，在承担学习、记忆功能外，在疼痛中也起着关键的作用。在动物实验研究中，海马的损毁或定点给药可以产生镇痛作用[24-27]。临床上，一些对常规镇痛方式没有反应的顽固疼痛患者在海马切除术后，疼痛症状得到缓解[28]。本研究采用更接近临床实际的咬合干扰刺激，通过给OVX大鼠施加EOI建立慢性咬肌痛敏模型，模拟临床咬肌疼痛状态，发现高浓度E2可加重 OVX大鼠慢性咬肌痛敏，并出现海马内ERK磷酸化水平上调，进一步解释了E2影响慢性咬肌疼痛的中枢机制。

既往研究发现，皮下注射80 μg/d E2时大鼠血清E2水平与自然雌性大鼠动情前期血清E2水平相似[29]，故本研究中去卵巢大鼠选择80 μg/d E2替代。行为学结果发现，在第17天(即用E2或vehicle替代10 d)，E2替代大鼠的双侧咬肌机械刺激反应阈值较无E2替代大鼠降低，说明高浓度的E2可以诱发慢性咬肌痛敏。该结果与Bi等[30]发现大鼠动情前期颞下颌关节(temporomandibular joint，TMJ)区痛阈最低的现象类似，Payrits等[31]研究也发现OVX小鼠动情前期的机械痛阈和热痛阈比动情期低。本研究第24天，无E2替代的单纯EOI组，较施加EOI前痛阈降低，且与同一天的OVX大鼠对照组相比痛阈降低，这与本课题组前期的研究结果[7]一致，说明EOI可导致OVX大鼠的咬肌痛敏，而给予E2替代的EOI组痛阈较单纯EOI组进一步降低，说明高浓度E2可加重EOI导致的咬肌痛敏。本研究及本课题组前期研究均发现右侧施加咬合干扰后大鼠双侧均出现咬肌痛敏，可能与EOI导致大鼠口颌系统的紊乱、双侧的咬肌均处于轻度拉伸状态、肌纤维收缩活动和代谢产物增加[32]、双侧伤害性传入增加、外周和中枢系统都发生敏化有关[6,33-34]。

在海马参与疼痛的中枢机制的研究中，选择内脏痛动物模型发现，N-甲基-D-天冬氨酸受体发生磷酸化促进海马CA1长时程增强，参与内脏痛敏的发生[35]；在CFA诱导的咀嚼肌炎性疼痛模型中，对海马局部进行TRPV1拮抗剂给药，大鼠双侧咬肌机械刺激反应阈值均降低[36]。本课题组建立的EOI导致的慢性咀嚼肌疼痛可被炎性痛记忆易化，且海马损毁可以逆转这种疼痛记忆的易化作用[25]。谷氨酸诱发的急性咬肌痛敏会导致海马p-ERK1/2表达增加，且E2可进一步增加p-ERK1/2的表达，从而加重咬肌痛敏[21]。在中枢系统中雌激素受体存在于大脑皮层、小脑、海马等位置[16]，本课题组前期通过免疫荧光染色发现海马中广泛存在与雌激素受体共定位的神经元[21]，这些都可能为海马参与E2相关疼痛提供分子生物学基础，且海马CA3区较CA1区有更多雌激素受体表达，提示E2在海马CA3区可能起到重要的作用。既往研究通过记录比较大鼠海马CA1、齿状回和CA3的场兴奋性突触后电位，发现E2可增强海马每个亚区的突触传递，其中在CA3区的联络纤维和连合纤维的增强幅度最大[37]。贾静[38]的研究也观察到海马CA1区和CA3区(以CA3区为主)的星形胶质细胞发生形态及功能学改变，表明海马CA3区与咬合创伤所致的口颌面痛关系密切，故本研究观察了CA3区的p-ERK1/2表达情况。E2和EOI两个因素都会导致ERK1/2通路被激活，其功能形式的磷酸化蛋白p-ERK1/2表达增加，且两因素叠加条件下，大鼠海马CA3区神经元p-ERK1/2的表达发生较为广泛的增加。在蛋白水平对海马内p-ERK1/2的表达进行定量分析，E2和EOI都导致ERK1/2磷酸化增加。EOI大鼠p-ERK1/2表达呈增高趋势，E2替代的EOI大鼠海马内p-ERK1/2表达显著增加，说明E2和EOI的联合作用可引起ERK的明显活化，E2进一步增加了EOI导致的海马p-ERK1/2上调。由此我们可以推测海马ERK1/2的磷酸化可能是E2加重EOI致OVX大鼠慢性咬肌痛敏的一个重要的中枢机制，这与Wu等[39]研究TMJ炎性痛的性别差异的机制结果较为相似，E2通过进一步增加TMJ炎症诱导的海马神经生长因子(nerve growth factor, NGF)、TRPV1上调加重痛敏，阻断海马NGF通路缓解痛敏，说明NGF-TRPV1通路可能参与E2诱导的雌性大鼠TMJ伤害性反应。本课题组的前期研究也发现了E2增加了双侧三叉神经节神经元的兴奋性，上调TRPV1受体表达，剂量依赖性加重EOI诱导的咬肌痛敏[29]，揭示了E2和EOI引起慢性咬肌痛敏可能的外周机制。然而，本研究仅能从现象上提示，海马中ERK1/2通路可能是E2促伤害作用通路之一，后续实验拟通过抑制海马ERK1/2通路，对该机制进行验证。对照组、OVX+E2组及OVX+EOI组三组的蛋白定量分析结果组间差异无统计学意义，但机械刺激反应阈值的组间差异有统计学意义，可能与EOI对大鼠的刺激较温和、引起疼痛的剧烈程度和疼痛相关蛋白的改变较小有关。蛋白定量分析结果提示E2和EOI交互作用不显著，推测E2和EOI可能通过不同的上游途径激活ERK通路，故仍需进一步深入探究海马参与高浓度E2和EOI加重慢性咬肌痛敏影响的具体机制。

本研究通过观察分析高浓度E2和EOI对OVX大鼠痛敏和蛋白表达变化的影响，发现了E2加重EOI导致的OVX大鼠慢性咬肌痛敏可能的中枢机制，即与海马内ERK1/2通路激活、p-ERK1/2表达量增高有关。流行病学研究发现，绝经后妇女颞下颌关节紊乱病相关疼痛发生风险增加和疼痛症状加重可能与接受E2替代治疗有关[40]，与本研究结果一致，有助于深入理解E2和EOI影响的咀嚼肌疼痛的中枢机制，为女性咀嚼肌疼痛患者寻找治疗方法提供理论基础。