细胞色素B-245α链及胆固醇酯转运蛋白基因多态性与广泛型侵袭性牙周炎易感性的关系

朱小玲，李文静，王宪娥，宋文莉，徐 莉，张 立，冯向辉，路瑞芳，释 栋，孟焕新△

(1.北京大学人民医院口腔科， 北京 100044； 2.北京大学口腔医学院·口腔医院牙周科，国家口腔医学中心，国家口腔疾病临床医学研究中心，口腔数字化医疗技术和材料国家工程实验室，口腔数字医学北京市重点实验室，北京 100081)

侵袭性牙周炎(generalized aggressive periodontitis， AgP)是一类临床和实验室检查结果均与慢性牙周炎明显不同的疾病，以快速的附着丧失和牙槽骨破坏为特征，具有家族聚集性[1]。大量研究表明， AgP是由多个基因相互关联或叠加，并与微生物、环境因素等协同作用所致。广泛型侵袭性牙周炎(generalized aggressive periodontitis，GAgP)是AgP的一个分型，通常发生于30岁以下的患者，主要的临床特点是广泛的邻面附着丧失累及至少3颗除切牙和第一磨牙以外的恒牙，有严重而快速的附着丧失和牙槽骨破坏等。

胆固醇酯转运蛋白(cholesteryl ester transfer protein，CETP)基因介导血浆脂蛋白之间脂质的交换和转运，尤其是促进高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)向低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)和极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)胆固醇转运，在胆固醇逆向转运中发挥重要作用[8-9]。CETP基因变异与脂蛋白代谢异常及动脉粥样硬化的研究已成为热点[10-11]，rs12720922(A/G)是一个新发现的CETP基因多态性位点，A等位基因携带者血清CETP升高[12]。

鉴于牙周炎与冠心病及代谢综合征存在共同的发病机制，本研究根据以往文献报道及GenBank数据库信息筛选出可能与AgP易感性有关联的两个基因多态性位点——CYBArs4673和CETPrs12720922，探讨其与GAgP易感性的关系及两者在GAgP 易感性方面是否存在交互作用，为筛选GAgP高危人群提供遗传学依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

本研究为病例对照研究，研究开始前已获得北京大学生物医学伦理委员会审查批准(批准号：0313)。所有受试者均签署知情同意书，并完成问卷调查，内容包括口腔卫生习惯、吸烟及全身健康状况等。

选择2001年 1月至 2015年 12 月期间于北京大学口腔医院牙周科门诊就诊的中国汉族GAgP 患者372例，选择同期133名全身及牙周均健康的本院汉族职工及在读学生作为对照组。GAgP诊断参照 1999 年牙周病分类国际研讨会制定的诊断标准，依据2018年牙周病和植体周病国际新分类，本研究纳入的GAgP均为牙周炎Ⅲ期C级(快速进展)。

GAgP组纳入标准：(1)年龄≤35岁；(2)快速的附着丧失和牙槽骨破坏，全口至少6颗牙(其中至少3颗为非第一磨牙和切牙)探诊深度(probing depth，PD)≥5 mm，邻面附着丧失(attachment loss，AL)≥3 mm；(3)经全口根尖X线片证实有邻面牙槽骨吸收。对照组纳入标准：(1)年龄≤35 岁；(2)PD≤3 mm，无附着丧失；(3)出血指数(bleeding index，BI)≥2 的位点数<10%，无BI为4的位点。

GAgP组及对照组排除标准：(1)吸烟；(2)患有糖尿病、心血管疾病或血液系统疾病等；(3)妊娠期或哺乳期女性。

1.2 临床检查

使用Williams牙周探针，测量每位受试者每颗牙6个位点的PD和AL(颊侧和腭侧的近中、中央、远中位点)；探诊30 s后记录出血最严重部位的BI。此外，GAgP患者拍摄全口根尖X线片。

1.3 基因型鉴定

每位受试者抽取外周静脉血至含有乙二胺四乙酸抗凝剂的真空管中，分离白细胞，提取全基因组 DNA(上海华舜生物技术有限公司)。CYBArs4673与CETPrs12720922基因型鉴定由上海邃志生物科技股份有限公司采用基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术完成(美国Sequenom 公司 MassARRAY 系统)。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 研究人群描述

2.1.1一般特征 372例 GAgP 患者平均年龄(27.5±5.2)岁，其中男性 152例，女性 220例，男女比1 ∶1.45；133名健康对照者平均年龄(28.8±7.1)岁，其中男性 53 例，女性 80例，男女比1 ∶1.51。两组人群年龄差异有统计学意义(P<0.05)， 性别构成比差异无统计学意义(P>0.05)。GAgP组的牙周临床指标(PD、BI、AL)与对照组相比，差异均有统计学意义(P<0.01，表1)。CYBArs4673与CETPrs12720922基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

2.1.2CYBArs4673基因型 共有366例GAgP患者及132名健康对照者检测出CYBArs4673基因型，检出率为98.6%(498/505)。将CYBArs4673的CT与TT基因型合并后，GAgP组CT/TT基因型频率显著高于对照组(18.03%vs.10.61%，P<0.05，表1)。

2.1.3CETPrs12720922 基因型 共有368例GAgP患者及132名健康对照者检测出CETPrs12720922基因型，检出率为99.0%(500/505)。CETPrs12720922基因型分布在两组间差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

表1 两组一般情况及基因型分布比较Table 1 Comparison of demographic, clinical characteristics and genotype distributions in patients and controls

2.2 GAgP患病风险多元回归模型分析

调整性别、年龄后，CYBArs4673不同基因型的GAgP患病风险差异存在统计学意义，与 CC基因型相比，CT/TT基因型患病风险明显增加(OR=1.86，95%CI：1.01～3.45，P=0.048)。CETPrs12720922不同基因型的GAgP患病风险差异无统计学意义，与GG基因型相比，AA/AG基因型患病风险无明显改变(OR=0.70，95%CI：0.43～1.12，P=0.138)。

2.3 CYBA rs4673与CETP rs12720922的交互作用分析

调整年龄、性别后，与CYBArs4673 CC基因型及CETPrs12720922 AA/AG基因型相比，CYBArs4673 CT/TT基因型及CETPrs12720922 GG基因型的GAgP患病风险增加了2.25倍(OR=3.25，95%CI：1.36～7.75，P<0.01)，而CYBArs4673 CT/TT基因型单独存在时OR值为1.86，表明CYBArs4673 CT/TT基因型与CETPrs12720922 GG基因型在GAgP患病风险方面的交互作用为协同作用(表2)。

表2 CYBA rs4673、CETP rs12720922基因与GAgP易感性的交互作用分析Table 2 Interaction analysis between CYBA rs4673 and CETP rs12720922 gene polymorphisms and susceptibility to generalized aggressive periodontitis

3 讨论

本研究根据既往文献报道及GenBank数据库信息，选择CYBArs4673和CETPrs12720922两个单核苷酸位点，分析它们与GAgP易感性的关系以及基因间的交互作用，发现CYBArs4673基因多态性与GAgP患病风险相关，与CC基因型相比，CT/TT基因型患病风险明显增加。进一步分析发现CYBArs4673和CETPrs12720922在GAgP易感性方面存在显著的交互作用，当CYBArs4673为CT/TT基因型，CETPrs12720922为GG基因型时，与CYBArs4673 CC基因型、CETPrs12720922 AA/AG基因型相比，GAgP患病风险明显增加，CYBArs4673 CT/TT基因型与CETPrs12720922 GG基因型在GAgP患病风险方面的交互作用为协同作用。

CYBA基因编码NADPH的p22phox跨膜亚基，其rs4673(C242T)的多态性导致p22phox亚基第72位组氨酸被络氨酸代替，从而影响NADPH氧化酶的活性及超氧化物产生。有关rs4673 C/T多态性对NADPH氧化酶功能的影响研究较少，而且结论并不一致[13-14]。超氧化物是杀灭细菌的关键物质，同时也会导致组织损害。过度的氧化爆发与一些疾病的病理发生有关，体外研究表明，其对牙周韧带细胞和牙龈上皮细胞都有损害[15-16]。Nibali等[6]通过病例对照研究的方法分析了CYBArs4673(C242T)多态性与AgP(特别是GAgP)易感性的关系，发现T等位基因频率在AgP组增高(CT基因型频率在高加索人群中增高，而TT基因型频率在黑人人群中增高)，表明CYBArs4673(C242T)多态性与AgP(特别是GAgP)的易感性相关。本研究也发现CT/TT基因型频率在GAgP组增高，与Nibali等[6]的研究结果一致。

早期的观点认为AgP发病与中性粒细胞功能缺陷(趋化、吞噬、杀菌等)有关，后来的研究结果提示，AgP严重的牙周组织破坏是由于中性粒细胞活性过度增强，释放过量的毒性产物引起的。Leino等[17]和Gronert等[18]报道AgP患者，特别是局限型侵袭性牙周炎(localized aggressive periodontitis，LAgP)患者的中性多形核白细胞(polymorphonuclear leukocyte, PMN)超氧化物产生增高。Shimo-Naka-nishi等[13]发现携带CYBArs4673T等位基因个体的中性粒细胞过氧化物产生活性明显增高，而Wyche等[14]发现CYBArs4673 TT基因型个体与CC/CT基因型个体相比，吞噬细胞的呼吸爆发活性明显降低。Nibali等[6-7]认为T等位基因突变可能是导致AgP患者中性粒细胞功能改变的机制之一。CYBArs4673基因多态性对AgP患者中性粒细胞NADPH氧化酶活性的影响还有待进一步研究。

CETP基因变异与动脉粥样硬化及脂蛋白代谢异常有关。Blauw等[12, 19]通过全基因组关联研究(genome-wide association study，GWAS)确定CETPrs12720922(A/G)是一个独立的且显著影响血清CETP水平的多态性位点，A等位基因携带者血清CETP升高，且血清CETP升高与血清HDL胆固醇降低及LDL和VLDL胆固醇增高有关，从而与冠状动脉疾病的危险性相关。Bordoni等[20]研究发现，心血管疾病患者与健康对照者的CETPrs12720922基因型频率无显著差异，A/G多态性与HDL水平明显相关，但与心血管疾病的危险性可能并无直接的相关关系。有关CETPrs12720922(A/G)多态性与牙周炎易感性的关系尚未见报道。本研究发现，CETPrs12720922基因型的分布在GAgP组和健康对照组间差异无统计学意义，通过基因间交互作用分析发现，CETPrs12720922 GG基因型与CYBArs4673 CT/TT基因型在GAgP患病风险方面具有协同作用。大量研究表明，血脂异常与牙周炎有密切关系，而且是双向的关系[21-23]，血脂异常增加了患牙周疾病的风险，而牙周感染也影响了血脂的控制。牙周炎作为一个慢性感染性疾病，产生大量的促炎症因子，引起血脂水平改变，导致高血脂的发生。血脂升高超过正常的生理范围，就会引起免疫细胞功能改变；脂类可以改变巨噬细胞多肽生长因子的基因表达，使得肿瘤坏死因子α和白细胞介素1β产生增多，从而增加了牙周炎的易感性[24]。另外，高血脂症患者PMN受到趋化肽N-甲酰甲硫氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine，fMLP)刺激时，氧自由基和血小板活化因子产生明显增高，PMN的过度活化可能与牙周炎的易感性相关[25]。CETPrs12720922(A/G)多态性可能通过影响血清CETP水平改变血脂水平，从而与CYBArs4673 CT/TT基因型在GAgP患病风险方面产生交互作用。这两个位点的单核苷酸多态性在GAgP易感性方面存在交互作用的机制还有待进一步研究。

综上，本研究发现CYBArs4673 CT/TT基因型频率在GAgP组增高，与GAgP易感性相关，而且与CETPrs12720922 GG基因型存在显著的交互作用。相对于单个基因的研究，本研究结果解释了GAgP发病机制中遗传因素的重要性，对预测人群的患病风险有一定意义。但同时本研究也存在一定的局限性，一是样本量不够大，这与GAgP发病率较低有一定关系，在后续工作中需进一步扩大样本量进行验证；二是本研究只是通过病例对照研究分析基因多态性与GAgP易感性的关系，尚未涉及基因多态性影响GAgP发生的具体机制，如CYBArs4673基因多态性对AgP患者中性粒细胞NADPH氧化酶活性的影响等。今后将从基因功能水平进一步探讨CYBArs4673参与GAgP发病的机制以及与CETPrs12720922产生交互作用的机制。