佛手和代代酸橙授粉对香橼果形的花粉直感效应研究

刘金莲， 王小青， 徐劲剑， 梅煜琳， 廖芳蕾,2， 陈文荣,2， 郭卫东,2

(1.浙江师范大学 化学与生命科学学院，浙江 金华 321004；2.浙江省特色经济植物生物技术重点实验室，浙江 金华 321004)

0 引 言

果形是园艺作物的重要生理性状，是食用价值和观赏价值的外在表现指标之一[1]，果形建成不仅影响果实的外观形态，也与果实质量、果实品质等密切相关[2]，研究果形的建成对改变果形、提高果实品质有重要意义.花粉直感效应对许多园艺作物的果形产生显著的影响[3-4]，且花粉中的遗传因子会对果形的发育起到重要调控作用[5-6].

目前果形发育的研究发现，番茄中SUN，CNR等基因分别在果实发育的不同阶段调控果形建成[7].SUN，YABBY基因主要在果形建成初期，即花芽分化和发育期中起至关重要的调控作用[7-8].实验证明，SUN作为正向调控因子编码影响果实伸长的基因[9-10]，能够有效控制番茄果形指数[7].SUN在授粉后开始启动[11].KAN2是心皮发育相关基因，该基因启动表示心皮发育在进行[12].CNR是控制胎座发育的基因，PavCNR12可控制甜樱桃果形，而与其高度相似的PbCNR6也能控制梨果形[13-14].CRC能够抑制花的分生组织发育，并且调控雌蕊发育[15].柑橘是世界上产量最高的果树，也是我国第一大水果，其果形相关基因研究领域存在较多空白，对花粉影响果形发育的机制和果形遗传方面的研究相对较少.

佛手、香橼同为芸香科柑橘属物种，但在果形上却存在极大差异[16].香橼(CitrusmedicaL.)果形一般呈现为椭圆形、近圆形或两端狭的纺锤形[17]，表面粗糙.佛手(Citrusmedicavar. L.sarcodactylisSwingle)是香橼的变种，果形顶端呈指状开裂[18].研究果形需要对果实外观进行准确描述，通常会采用果形指数作为参考，即测量果实横纵径.果形指数是衡量苹果外观质量的主要指标，通常果形指数越接近1，表明该果实越端正[19].已有研究表明，梨[20]、猕猴桃[21]等外形规则的果实，在生长发育过程中，果形指数会发生变化，且同一物种不同品种间果形指数同样也存在差异[22].而对于佛手等不规则形态的果实，则需测量果实最长横径和最宽纵径，对果实进行跟踪测量.

本实验室前期研究发现，佛手和香橼果形差异从花芽发育时期开始.在佛手和香橼开花当天花和叶的组织中，检测到SUN家族基因及YABBY家族基因在雌蕊上的表达差异[18]，推测上述家族其他基因也可能会参与雌蕊到果实的形态建成.通过预实验已检测CNR，CRC，SUN，KAN2，YABBY2，YABBY5等基因在香橼和佛手的花芽发育阶段存在表达差异，因此，本文将以上述基因为参考继续探讨果形差异和基因表达差异的相关性.代代酸橙(C.aurantiumvar.daidaiTanaka)的果形在经过园艺栽培后有诸多形态，本文选择以果顶有较深的放射沟直达果基，果实表面有凹凸纵向纹路的代代酸橙为研究材料.研究以佛手、香橼和代代酸橙这3种花粉为父本，以香橼为母本进行授粉，对香橼果形发育的形态学数据追踪观测，在各授粉组香橼的雌蕊的mRNA检测上述5种果形建成相关基因的表达.通过研究佛手、代代酸橙花粉对香橼果形的影响，以期了解柑橘属花粉直感对果形发育的影响及可能的作用机理，为芸香科植物果形研究提供新的思路.

1 材料与方法

1.1 实验材料

选择生长状况一致且无病虫害的三年生香橼共10株，作为本次实验的母本材料，对其进行适当修剪，每株保留相同数目的花芽，进行相同的水肥管理.收集开花当天的佛手、香橼及代代酸橙开放花的新鲜花粉作为本次实验的父本材料.实验于2018年2月—2018年12月在大棚内进行.

1.2 实验方法

1.2.1 组别设置

在大小合适的3组香橼花序上用镊子除去多余的雄花和已开的雌花，保留同样数目的雌花，并对其进行前期套袋处理和分组挂牌标记，防止其他花粉对实验产生干扰.

每个花粉授粉组选择3株香橼为母本，设1，2，3株为香橼花粉授粉组，4，5，6株为佛手花粉授粉组，7，8，9株为代代酸橙花粉授粉组，其中第3，6，9株用作观察，其余植株用作取样；第10株香橼不作处理，用作空白组的取样拍照等.

1.2.2 花粉的采集冻存和授粉套袋

在佛手、香橼、代代酸橙开花的当天，用镊子剥离花药，置于26～28 ℃条件下24 h，待花粉自然散粉后，收集成熟的花粉轻柔放入离心管中，在离心管上标明取样日期及花粉种类.取样结束后迅速将花粉放入冰盒中，再放入-80 ℃的冰箱中低温冻存.

对前期去雄套袋处理的花芽进行授粉，将佛手、香橼和代代酸橙花粉分别授粉香橼柱头(花粉在柱头上均匀涂抹3次，尽量使每个柱头上的花粉数量一致)，授粉处理完毕后重新套袋，并进行挂牌标记.

1.2.3 果形观察及生长数据追踪记录

定期观察并拍照记录3组花粉授粉组果实形态的变化,用游标卡尺分别测量果实的横径和纵径，果形指数为纵径和横径的比值.观察果实的颜色变化、突起、褶皱的有无等形态特征，及时记录香橼果实有落果或者生长状况不佳的情况.

1.2.4 香橼雌蕊的收集和冻存

参考前期栽培经验，将香橼花期分为开花前7天、开花授粉当天及授粉后7天共3个时期进行取样，并将样本置于-80 ℃冰箱中冷冻保存.

1.2.5 荧光定量PCR

根据Trizol C Invitrogen试剂盒的方法提取事先冻存的3种花粉和各组花芽样本的RNA，参照Vazyme公司的HiScript®Reverse Transcriptase反转录说明书合成转录的特定基因的cDNA第一链，β-actin验证cDNA产物.

使用生物信息学技术设计果形相关基因序列，使用Primer Premier 5.0软件设计引物，引物序列合成于生工生物工程有限公司(上海).

以各样品cDNA为模板，β-actin作为内参基因，在模板内分别加入不同目的基因引物，按照SYBR® Premix Ex TaqTM PCR Kit试剂盒(艾德莱，北京)配制反应体系，通过荧光定量PCR仪(型号：ABI PRISM 7000)进行实时荧光定量PCR实验.实时荧光定量的程序为：95 ℃预变性5 min，95 ℃ 30 s，退火温度30 s，72 ℃ 30 s，40个循环，反应体系为20 μL，含200 ng cDNA，10 μL SYBRGreen PCR mix，10 μM的上下游引物各0.8 μL，最后用双蒸水补足.每个基因和每个样品均进行3个生物学重复，采用2-△△CT方法计算基因相对表达量.

表1 荧光定量 PCR 引物

1.3 统计分析

使用SPSS 19.0进行统计分析，SigmaPlot 14.0绘制图表，采用Duncan检验进行单因素(One-way ANOVA)方差分析(P<0.05).

2 结果与分析

2.1 香橼、佛手、代代酸橙的果形比较

在果实成熟期，香橼果形一般呈果顶果脐尖的纺锤形，佛手具有指状的开裂.代代酸橙的果形具有纵向突起，全果有瘤状褶皱，但纵向突起不分裂的形态.以上3种果形如图1所示.在预实验中发现，与佛手和代代酸橙种在一起的香橼果皮更加粗糙，因此，在第2年对该香橼进行去雄套袋处理，观察不同花粉授粉后的果形是否确实发生了变化.

图1 香橼、佛手、代代酸橙果形图

2.2 不同授粉组香橼的果形差异

经过2年授粉的统计数据表明，在佛手授粉和代代酸橙授粉组，均有90%以上的果形出现变异.从形态外观上比较，自交授粉香橼果形呈现为中间圆，顶端狭的纺锤形，果皮表面较光滑(见图2a～2b).代代酸橙花粉授粉后的香橼表面出现纵向轻微褶皱突起现象(见图2c～2d).佛手花粉授粉后的香橼相对更加狭长，表面粗糙，果皮不光滑程度大大加深，除了纵向的褶皱突起，突起部分不连续，导致果皮上出现瘤状突起(见图2e～2f).果形指数显示，代代酸橙与佛手授粉的果实果形指数偏小(见图2g)，即果形偏扁平.

a:香橼花粉授粉组未成熟香橼；b:香橼花粉授粉组成熟香橼;c:代代酸橙花粉授粉组未成熟香橼；d:代代酸橙花粉授粉组成熟香橼；e:佛手花粉授粉组未成熟香橼；f:佛手花粉授粉组成熟香橼；g:授粉后的果形指数比较

2.3 果形相关基因在花粉和授粉前后柱头上的表达分析

在授粉前，对果形相关基因在3种花粉中的相对表达量进行分析(见图3)后发现，CNR基因在香橼花粉中的表达量远高于其他2种花粉，在佛手花粉中表达最低.CRC和YABBY5基因在佛手花粉中表达量最高，在香橼和代代酸橙花粉中仅有微量表达；SUN基因在代代酸橙花粉中的表达量极低，在香橼和佛手花粉中表达量稍高，但表达总量仍处较低水平.由于YABBY2仅在香橼花粉中检出，在佛手和代代酸橙中无法检出，因此，对YABBY2基因的相对表达量分析未完成.KNA2在3种花粉中表达量都较低，无法分析.

观察各基因在不同花粉授粉的雌蕊中相对表达量(见图4)发现，CNR基因授粉后的表达量在自交组呈上调趋势，在佛手和代代酸橙授粉后并未上调，尤其在代代酸橙组下调更明显.CRC基因在佛手授粉当天的表达量有突增现象，各组都在授粉后表达显著下调.SUN基因在自交组和佛手授粉组中授粉当天显著上调，自交组授粉后相对授粉当天下调，但高于授粉前；SUN基因在代代授粉后表达量无显著差异.KAN2基因授粉后的表达量在佛手组变化不显著，在自交组出现上调趋势，而在代代酸橙组出现下调趋势.3个授粉组中的YABBY2基因表达趋势总体相同，授粉后表达量都呈上调趋势.YABBY5基因的表达在3个授粉组中均为授粉后下调，且低于授粉前；在代代酸橙授粉组中，在授粉当天显著增高，其余2组并未有显著差异.

图4 果形相关基因在不同花粉授粉的香橼雌蕊相对表达量

3 讨论与结论

为了探讨花粉直感是否在柑橘属作物果形建成中发挥作用，对不同花粉授粉后的香橼果实形态进行了研究.通过比较自交组香橼花芽不同发育时期后发现，香橼雌蕊授粉前的发育明显有一个纵向快速生长阶段，而开花授粉后不同外源花粉的介入会影响花芽中这些基因的表达，这可能是不同花粉授粉导致香橼果形变化的内在分子机理之一.不同外源花粉介入后可能会改变香橼横纵轴发育的起始时间点，从而在一定程度上改变果形.各组授粉后的香橼果实在横向上出现快速增长，导致果形指数发生变化.佛手花粉能使香橼果形在横轴上有明显的纵裂凸起，使香橼原本的长圆形果形性状出现畸变；而代代酸橙花粉会使香橼果形变得扁平，同时也能轻微加深表皮凹痕.由此可见，花粉直感确实能改变香橼果形.根据果形相关基因在花芽与花粉的mRNA表达模式分析，可总结出结果，见表2及图5.

表2 果形相关基因在花芽与花粉的mRNA表达模式分析

已有研究表明，CmsSUN20在佛手和香橼中的表达有显著差异，可能是导致佛手果实长度大于宽度的原因[18].SUN基因在佛手、香橼花粉中的表达量高于代代酸橙，而佛手、香橼花粉授粉当天SUN表达量上调，代代酸橙授粉后并未有显著性改变，即花粉中的SUN影响了授粉后的花柱；结合果形特征分析，SUN基因可能与果形狭长呈正相关.KAN2是心皮发育相关基因[12]，本实验在花粉中未检测到KAN2基因的表达，推测KAN2基因可能来自母本；KAN2在自交组的3个时期表达量一直呈上升趋势，但在佛手和代代酸橙授粉组中分别呈现授粉后无显著差异或者下调趋势，这可能导致佛手和代代酸橙组授粉的果实表皮特征不同.KAN2基因的表达可能与香橼果实表皮平整相关.本实验中CRC在佛手花粉中表达量远远高于其他2个物种，CRC在佛手授粉后确实引起了表达量的突增，即CRC可能与果形指状开裂有关.YABBY5在佛手花粉中表达量也高于其他2种花粉，但是香橼、佛手花粉的授粉都未显著改变YABBY5在授粉当天雌蕊中的表达，仅在代代酸橙授粉当天表达上调，授粉后表达又显著低于授粉前，推测YABBY5可能与果形拉长负相关.YABBY2在除香橼外的花粉中未检测到表达，却在3组授粉当天显著下降，授粉后表达上调.上述结果暗示，YABBY2与授粉的花粉种类无关，推测该基因可能来自母本，且与果形的发育关系尚不明确，可能与香橼果形平滑相关.有报道发现，CNR基因在胚珠中表达[23].本实验香橼自交授粉后的CNR表达显著上调，但佛手与代代酸橙花粉在授粉后并未显著改变CNR的表达，且在代代酸橙授粉后表达显著下调；结合佛手胚珠败育[24]、代代酸橙种子败育等性状，本实验验证了CNR与胚珠发育相关，推测其与果皮平滑相关.

以果形发育的形态观察为基础，根据佛手、香橼、代代酸橙的果实特点设置6个果形性状：香橼设纺锤形与表皮平整；代代酸橙设扁平形与表皮皱纹；佛手设狭长型指状开裂与表皮纵裂.这些特征可归纳为果皮特征和形态特征(见图5).同时，总结上述果形基因表达的模式分析(见表2)，笔者确定了CRC，SUN，KAN2，CNR，YABBY5这5个基因在香橼果形发育中发挥的可能作用(见图5).与对照相比，佛手花粉授粉后香橼果形的横轴上出现明显的纵裂凸起，凸起位置在果皮上随机分布；代代酸橙花粉授粉后香橼果形变扁平，并加深了表皮凹痕，这些形态特征可能由SUN，CRC，PbCNR6共同调控，而果皮的光滑或开裂由KAN2，CNR共同调控.SUN，YABBY5基因与果形拉长相关；CRC基因表达上调可能与指状开裂启动有关；推测KAN2可能与果实表皮平整相关；CNR基因与胚珠发育有关.但本次实验尚不明确YABBY2基因与果形的关系，需要继续开展类似实验来对其进行探究.挖掘新的果形建成基因，并建立这些基因之间的关系，是未来果实形态建成的研究趋势之一[25].后续研究将会扩大实验样本规模和基因数量，继续发掘新的果形相关基因，并尝试寻找不同果形相关基因之间的可能关联.

图5 果形特征和基因关联图