酸笋中高产甘露醇异型发酵乳酸菌的筛选及其发酵性能

卢宏皓，刘昭明，黄翠姬，虞珂娜，万堃华

(广西科技大学 生物与化学工程学院，广西 柳州 545006)

异型发酵乳酸菌(heterofermentative lactic acid bacteria)是指能够进行异型发酵代谢[1]，除生成乳酸外还生成CO2、乙醇和甘露醇等多种物质的乳酸菌。与同型发酵乳酸菌(homofermentative lactic acid bacteria)相比，异型发酵乳酸菌生成的乳酸相对较少，但是由于其可以生成甘露醇、乙醇等风味物质，赋予发酵产品更好的风味与口感，所以异型发酵乳酸菌被认为是更好的蔬菜腌制的发酵菌种[2]。有研究表明，使用乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)和柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)混合发酵韩国泡菜，改善了泡菜的风味特性，延长了泡菜的货架期[3]；在韩国泡菜发酵中采用柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)进行发酵可以提高产品的品质。异型发酵乳酸菌可以增加发酵食品的风味，与其发酵过程中生成的代谢产物甘露醇密切相关。Choi等[4]研究发现模式泡菜的感官偏好与甘露醇浓度呈正相关；云琳等[5]认为甘露醇是萝卜泡菜的特征性风味物质，具有清爽的甜味。

异型发酵乳酸菌是发酵法生产甘露醇的优良菌株[6]，因此有关优良异型发酵乳酸菌的分离鉴定与发酵性能研究是其应用于改善发酵食品风味的基础。发酵酸笋是以竹笋为原料经发酵制得的发酵食品，为柳州螺蛳粉的重要配菜，是形成螺蛳粉独特“酸爽”风味的重要食材，而风味物质的形成依赖于异型乳酸菌的代谢。长期以来，酸笋的生产主要以小作坊的自然发酵法为主要模式，其产品质量及安全性难以保证。目前，就我们所知，国内尚未见到有从酸笋中分离异型乳酸菌的报道。为了获得适用于酸笋接种发酵的异型乳酸菌，本研究以甘露醇为指标，从自然发酵酸笋中筛选出产甘露醇的异型乳酸菌，并对其性能进行研究，为异型乳酸菌接种发酵酸笋提供了指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

竹笋：购自广西柳州市区桂中菜市场。

MRS液体培养基：蛋白胨10 g，酵母膏4 g，牛肉膏5 g，柠檬酸三铵2 g，葡萄糖20 g，吐温80 1 mL，无水乙酸钠5 g，磷酸氢二钾2 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.05 g，蒸馏水1000 mL，pH 6.5±0.2。

MRS固体培养基：在MRS液体培养基中添加2%(W/V)琼脂粉。

MRS选择培养基：在MRS液体培养基中额外添加2%(W/V)果糖。

引物27F/1492R：北京索莱宝科技有限公司；EB替代染料：北京普利莱基因技术有限公司；TBE buffer、2×Taq PCR MasterMix II、去离子水：天根生化科技有限公司。

其余化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

E220双目生物光学显微镜 麦克奥迪实业集团有限公司；H3-18KR台式高速冷冻离心机 湖南可成仪器设备有限公司；P3PC紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；TC-XP-G XP基因扩增仪 杭州博日科技有限公司；LRH-250生化培养箱 广东省医疗器械厂。

1.3 实验方法

1.3.1 产甘露醇乳酸菌的分离与鉴定

1.3.1.1 酸笋发酵

将鲜笋剥皮，清洗干净，切分成长约4 cm、宽约3 cm、厚约0.5 cm的片状，自然晾干后装入2 L发酵瓶中(装瓶量为容积的1/2)，然后加入凉白开水浸没过鲜笋表面，封盖自然发酵。

1.3.1.2 乳酸菌初筛

初筛的目的是从酸笋发酵液中分离纯化出具有乳酸菌特征的菌株。因此，取第1，3，5天的酸笋发酵液各1 mL，用生理盐水进行10倍梯度稀释，采用倾注法[7]取适宜梯度的样品稀释液1 mL混匀于含有2% CaCO3的MRS平板上，30 ℃培养48 h，同时接种1 mL生理盐水作为空白对照。从平板中挑取有明显溶钙圈的单菌落接种于新的MRS平板进行分离纯化，纯化3～4代，将分离纯化所得的革兰氏染色阳性、过氧化氢接触酶阴性的菌株转接于斜面，30 ℃培养48 h后于4 ℃保藏[8]。

1.3.1.3 乳酸菌复筛

复筛的目的是从初筛得到的乳酸菌菌株中筛选具有产甘露醇能力的异型发酵乳酸菌。将初筛获得的菌株接入MRS液体培养基中30 ℃培养24 h，连续活化2次后按1%(V/V)接种于MRS选择培养基中继续培养24 h后取1.5 mL发酵液经离心机离心(4 ℃，10000 r/min，10 min)，取上清液，采用改进的高碘酸钠氧化法测定其中甘露醇含量[9]。收集甘露醇产量大于18 g/L的异型发酵乳酸菌菌株。

1.3.1.4 分子生物学鉴定

将获得的目标菌株接种于MRS液体培养基中，30 ℃培养24 h，8000 r/min离心2 min，弃上清液，收集离心到的菌体并以其为模板，利用细菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R (5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增细菌16S rDNA基因。在50 μL的反应体系中加入DNA模板2 μL，27F引物1 μL，1492R引物1 μL，2×Taq PCR MasterMix II 10 μL，ddH2O 6 μL。

PCR扩增条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共30个循环；72 ℃再延伸10 min。

PCR扩增产物送交华大基因公司进行16S rDNA测序，所得序列在NCBI中进行比对，确定菌株，采用MEGA 7.0构建系统发育树。

1.3.2 异型发酵乳酸菌生长曲线的测定

将获得的高产甘露醇菌株于30 ℃培养24 h后按1%(V/V)接种于MRS液体培养基中培养，每3 h取菌液适当稀释后测定其在波长600 nm处的吸光度值，绘制乳酸菌的生长曲线。

种子液制备：取供试菌种接种至MRS液体培养基中，30 ℃培养24 h，然后取1%(V/V)发酵液接种于新的MRS液体培养基中继续培养12 h作为种子液。

1.3.3 异型发乳酸菌产酸能力的测定

在MRS液体培养基中接入1%(V/V)的种子液，30 ℃培养24 h后取发酵液经离心后测定总酸含量。总酸含量的测定参照GB/T 12456-2008《食品中总酸的测定》，含量以乳酸计。

1.3.4 异型发酵乳酸菌降解亚硝酸盐能力的测定

在已灭菌的含有10 μg/mL亚硝酸钠的MRS液体培养基中接入1%(V/V)的种子液，30 ℃培养24 h。

将发酵液离心后取1 mL上清液置于100 mL容量瓶中，加入2.5 mL 50 g/L饱和硼砂溶液,加入70 ℃左右的水约50 mL，混匀，于沸水浴中加热 15 min，取出置于冷水浴中冷却，并放置至室温。加入1 mL 106 g/L亚铁氰化钾溶液，摇匀，再加入1 mL 220 g/L乙酸锌溶液,以沉淀蛋白质。加水至刻度，摇匀，放置30 min，除去上层脂肪，上清液用滤纸过滤,弃去初滤液15 mL，滤液备用。

亚硝酸盐的测定方法参照GB 5009.33-2016《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》。

1.3.5 异型乳酸菌产甘露醇特性实验

1.3.5.1 果糖浓度与菌株产甘露醇的关系

将MRS液体培养基中的葡萄糖换成果糖，使培养基中果糖终浓度分别为20，40，60，80，100 g/L。在不同果糖浓度的培养基中分别接入1%(V/V)种子液，30 ℃培养48 h后取发酵液经离心后测定甘露醇含量。

1.3.5.2 pH值与菌株产甘露醇的关系

MRS发酵培养基：根据1.3.5.1的结果选择最优果糖含量的MRS果糖培养基，调节pH值为5.0，6.0，7.0。

根据1.3.3～1.3.5.1的结果选择发酵性能最优的菌株，在不同pH值的MRS发酵培养基中接入1%(V/V)的种子液，30 ℃培养48 h，以不接种的果糖培养基作为对照组，以蒸馏水为空白并分别在0，8，24，48 h测定pH值、乳酸菌总数、甘露醇及总酸含量。

1.4 统计学分析

每组3个平行试样，数据表示为平均值±标准差形式。使用SPSS 22.0进行数据分析，采用ANOVA进行显著性分析，显著水平P<0.05，以不同字母表示，利用Microsoft Office Excel 2010、Origin 9、MEGA 7.0软件进行数据计算和图形制作。

2 结果与讨论

2.1 高产甘露醇异型发酵乳酸菌的分离筛选

从自然发酵酸笋中共分离、纯化得到108株菌株，经革兰氏染色和过氧化氢酶试验，共得到61株革兰氏染色为阳性、过氧化氢为阴性的菌株，分别编号为1～61号，部分菌株的菌体形态见图1。将初筛获得的菌株在选择培养基中培养发酵，取其发酵液与高碘酸钠试剂反应，测定发酵液颜色变化较深的6株菌株的甘露醇含量，结果见图2。

图1 部分菌株的菌体形态Fig.1 The mycelial morphology of some strains

图2 甘露醇产量

由图2可知，3号、11号、12号菌株的甘露醇产量较高，产量达18 g/L以上，分别为18.43，18.30，18.03 g/L，其余菌种的甘露醇产量相对较低，达不到18 g/L，故弃去。选取3号、11号、12号菌株进行后续实验测定。

2.2 异型发酵乳酸菌生长动力学

测定3号、11号、12号 3株异型发酵乳酸菌的生长曲线，结果见图3。

图3 乳酸菌生长曲线Fig.3 The growth curves of lactic acid bacteria

由图3可知，3株菌在0～3 h生长缓慢，为生长延滞期，在3 h后生长迅速，3～12 h为对数生长期，此时乳酸菌迅速生长繁殖，在12 h时OD值达到高峰并保持相对稳定，此时，活菌数不再增加，进入生长稳定期。3株菌均在12 h进入对数生长末期，处于对数生长期的菌种活性最高，此时接种可使菌体活性最高，所以种子液培养时间选择12 h。

2.3 异型发酵乳酸菌的发酵性能

2.3.1 产酸能力

通常，异型发酵乳酸菌在发酵过程中的产酸能力不如同型乳酸菌，但是其产酸能力仍然是重要的发酵性能指标，产酸能力强，有利于抑制杂菌的生长，提高产品的安全性[10]。3号、11号、12号3株异型发酵乳酸菌的产酸能力测定结果见图4。

图4 培养24 h乳酸菌产酸量Fig.4 The acid yield of lactic acid bacteria cultured for 24 hours

由图4可知，培养24 h后，3株菌的产酸量分别为6.68，6.86，6.81 g/L，是具有较好产酸能力的优良菌株。本研究的结果高于孔彦卓等[11]从豆清发酵液中分离的高产酸肠膜明串珠菌，其产酸量低于6 g/L。

2.3.2 降解亚硝酸盐能力

在竹笋腌制的过程中，同其他腌制蔬菜一样，极易产生亚硝酸盐，对人体有潜在的危害。长期食用含大量亚硝酸盐的食品，会引发致癌甚至死亡的危险。使用乳酸菌降解亚硝酸盐含量具有重要意义[12]。3号、11号、12号亚硝酸盐降解量见图5。

图5 乳酸菌降解亚硝酸盐能力Fig.5 The degradation ability of lactic acid bacteria on nitrite

由图5可知，培养液中3株菌亚硝酸钠剩余量分别为2.55，2.68，1.94 μg/mL，其中12号菌株的降解能力最强，亚硝酸盐降解率为79.05%。高于相同培养时间下孟宪刚等[13]分离得到的乳酸菌亚硝酸盐降解率(5%～60%)。

2.4 异型乳酸菌产甘露醇的能力

2.4.1 果糖浓度对甘露醇产量和转化率的影响

异型乳酸菌通过利用甘露醇脱氢酶将果糖转化为甘露醇等有利的代谢产物，改善风味，还能降低食品中糖含量，适于肥胖和糖尿病等人群食用。甘露醇产量和果糖转化率见表1。

表1 甘露醇产量及果糖转化率Table 1 The mannitol yield and fructose conversion rate

由表1可知，果糖浓度从20 g/L到60 g/L，所有分离株的甘露醇产量都有大幅度增加。其中12号菌株在40 g/L果糖浓度下的甘露醇含量最高(21.90 g/L)，果糖转化率为54.75%。随着果糖浓度从60 g/L增加到100 g/L，所有菌株的甘露醇产量开始下降，只有12号菌株在100 g/L果糖浓度下其甘露醇产量超过40 g/L，这说明12号菌株是比较优良的产甘露醇的菌株，后面对其进行进一步的研究。

2.4.2 初始pH值对果糖发酵的影响

12号菌株在不同初始pH值的培养基中甘露醇产量、总酸、pH值以及乳酸菌总数见图6和图7。

图6 不同初始pH条件下12号乳酸菌的pH值及乳酸菌生长计数Fig.6 The pH value and growth count of No.12 Lactobacillus under different initial pH values

图7 不同初始pH条件下12号乳酸菌的甘露醇及总酸产量Fig.7 The mannitol and total acid yield of No.12 Lactobacillus under different initial pH values

由图6和图7可知，在初始pH为5，6，7的条件下，12号菌株都能利用果糖生产甘露醇，且在pH 5的条件下培养48 h获得了最高甘露醇产量(22.98 g/L)、最低pH值(4.03)和最高总酸含量(1.31%)。

当果糖是唯一的碳源时，异型乳酸发酵可将果糖还原为甘露醇，最大理论产率约为67%。12号菌在初始pH 5的条件下发酵48 h甘露醇产量最高，为22.98 g/L，其产率达到57.45%，而在初始pH为6和7时甘露醇得率分别为55.48%、50.45%，较初始pH为5时甘露醇得率低，说明适当降低初始pH可提高分离株的甘露醇产量。Saha等[14]研究发现中间乳杆菌产甘露醇的最佳pH值为5。Yue等[15]研究发现，采用两段pH控制(即前12 h pH 5.5，其余发酵时间pH 4.5)可以提高短乳杆菌的甘露醇产量。

在6.45 log CFU/mL的接种量时开始发酵，不同pH条件下培养基中乳酸菌总数在发酵前8 h增长迅速，且以初始pH 7的乳酸菌增量最大，在8 h时达到9.11 log CFU/mL，说明不同初始pH值可以影响初始乳酸菌数量的增加[16]。随着发酵过程的进行，pH降低，乳酸菌含量在8 h后减少。

2.5 乳酸菌16S rDNA基因序列分析

将12号菌株所得序列在NCBI中进行比对，采用MEGA 7.0构建系统发育树，见图8。

图8 基于16S rDNA序列12号乳酸菌株的系统发育树Fig.8 The phylogenetic tree of No.12 Lactobacillus based on 16S rDNA sequence

Romi Wahengbam等[17]通过对竹笋发酵进行连续7 d的微生物群落结构和种群动态分析，发现在发酵早期(1～3 d)存在较多Leuconostoccitreum、Weissellacibaria等异型乳酸菌。由图8可知，12号菌株与Leuconostoccitreum聚于一支，同源性均在99%以上，因此被鉴定为柠檬明串珠菌，将12号菌株命名为柠檬明串珠菌NM-12(LeuconostoccitreumNM-12)。

3 结论

本研究从自然发酵酸笋中共分离得到61株乳酸菌，通过复筛及性能测定，选出一株高产甘露醇乳酸菌，经分子生物学鉴定，该菌株为柠檬明串珠菌，命名为柠檬明串珠菌NM-12(LeuconostoccitreumNM-12)。通过对其发酵性能测试可知，LeuconostoccitreumNM-12菌株的产酸量为6.81 g/L，亚硝酸钠降解率为79.05%，在pH 5、果糖含量为40 g/L的条件下30 ℃培养48 h，其甘露醇产量为22.98 g/L，最大果糖转化率为57.45%。