反相高效液相色谱法测定鲨肝醇片的含量

宋玉琴，宋 青，董 芳

（淄博市食品药品检验研究院，山东 淄博 255086）

鲨肝醇片是一种升白细胞药，临床上主要用于防治因放射治疗、肿瘤化疗及苯中毒等引起的粒细胞减少症[1]，其主要成分为3-（十八烷氧基）-1,2-丙二醇[2]。《卫生部药品标准》（化学药品及制剂第一册）鲨肝醇片含量测定采用氯仿提取间接滴定法[3]，并用空白试验校正。该方法消耗滴定液的量少，误差大，准确度低，且操作繁琐、专属性差。目前文献报道的鲨肝醇片含量测定方法有高效液相色谱-蒸发光散射检测法（HPLC-ELSD）[4]、气相色谱法[5]、容量分析法[6]、近红外光谱法[7]。HPLC-ELSD定量需采用对数指数法进行计算，且基线易漂移、噪音大；气相色谱法需使用内标物，成本较高；容量分析法只是稍作变化，并无实质性改进；近红外光谱法数学模型的建立难度大，模型的好坏直接影响预测的结果和以后的使用。本文采用HPLC紫外检测法测定鲨肝醇片的含量，结果表明该方法普及度高、操作简便、分析速度快、准确度高。

1 仪器与材料

1.1 仪器

LC-20A型高效液相色谱仪，包括LC-20AT型四元梯度泵、SPD-20A型紫外检测器、SIL-20A型自动进样器、CTO-20A型柱温箱、LC solution色谱数据工作站（日本Shimadzu公司）；CP225D十万分之一天平（德国Sartorius公司）；超纯水仪（美国Millipore）。

1.2 试药

鲨肝醇原料药（含量99.8 %，江苏鹏鹞药业有限公司）；鲨肝醇片（批号：1912111，1912112，1912113，规格20 mg，江苏鹏鹞药业有限公司）；甲醇（色谱纯），乙腈（色谱纯），水为纯化水（自制）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（90:10）；检测波长：200 nm；流速：1.0 ml/min；柱温：30 ℃；进样量：20 μl。

2.2 溶液的制备

对照品贮备液：精密称取鲨肝醇原料药适量，用甲醇配制成含鲨肝醇10.4 mg/ml的溶液，摇匀。

对照品溶液：精密量取对照品贮备液适量，用甲醇稀释制成含鲨肝醇1.04 mg/ml的溶液，摇匀。

供试品溶液：取本品20片，精密称定，研细，精密称取片粉适量（约相当于鲨肝醇20 mg），置于20 ml量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.22 μm）过滤，取续滤液，即得。

空白溶液：精密称取处方比例的空白辅料，置于20 ml量瓶中，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.22 μm）过滤，取续滤液，即得。

2.3 专属性试验

取对照品溶液、供试品溶液、空白溶液，按2.1项色谱条件进样。结果显示，鲨肝醇理论板数＞8000，与空白辅料峰分离度均＞1.5，表明空白辅料不干扰测定，色谱条件的专属性良好，色谱图见图1。

图1 HPLC图谱

2.4 线性关系试验

精密量取对照品贮备液（10.4 mg/ml）0.25，0.5，1.0，2.0，5.0 ml，分别置于10 ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为系列对照品溶液，分别进样测定，以对照品溶液质量浓度（x）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标，制作标准曲线。结果回归方程为y=789 293x+18 654（r=0.9999），表明鲨肝醇检测质量浓度线性范围为0.26～5.2 mg/ml。

2.5 精密度试验

取对照品溶液，连续进样6次，测得鲨肝醇峰面积的RSD分别为0.5 %（n=6），表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液（批号：1912111），分别于0，2，4，6，8，12 h进样，记录色谱图，结果峰面积的RSD为0.6 %（n=6），表明供试品溶液在12 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取同一批号样品（批号：1912111）平行制备6份供试品溶液并测定，测得鲨肝醇片含量的平均值为99.8 %，RSD为0.6 %（n=6），表明方法重复性良好。

2.8 回收率试验

取已知含量的样品（批号：1912111），精密称取片粉（约相当于鲨肝醇10 mg）6份，分别置于20 ml量瓶中，分别精密加入对照品储备液1 ml，加甲醇超声溶解并稀释至刻度，摇匀；用微孔滤膜（0.22 μm）过滤，取续滤液进样，计算加样回收率，结果平均回收率为98.73 %（RSD=0.84 %，n=6），表明方法准确度较好，详见表1。

表1 回收率试验结果（n=6）

2.9 检测限和定量限试验

取对照品溶液，用甲醇稀释成一系列质量浓度的溶液，进样，记录色谱图。信噪比为3时所对应的浓度为检测限，测得鲨肝醇的检测限为775 ng/ml；信噪比为10时所对应的浓度为定量限，测得定量限为2.58 μg/ml。

2.10 样品含量测定

取不同批号样品，每批样品取3份，按本文建立方法和部颁标准方法分别测定含量，两种方法含量测定平均值分别为100.1 %，92.2 %，RSD值分别为0.26 %，1.85 %；结果表明该方法较标准方法含量测定结果偏高，误差较小。详见表2。

表2 两种方法含量测定结果比较（%）

2.11 耐用性试验

取对照品溶液和供试品溶液，在其他色谱条件不变的情况下，分别改变流速、流动相比例、柱温、检测波长、色谱柱品牌，分别测定样品含量（批号：1912111），结果表明该色谱条件耐用性良好。详见表3。

表3 耐用性试验结果

3 讨论

鲨肝醇原料药溶解度试验表明：鲨肝醇在甲醇中溶解度较好，乙腈次之，乙腈-水最差，且由于鲨肝醇结构中含两个醇羟基，根据相似相溶的原理最终选用甲醇作为溶剂；经扫描，鲨肝醇在200 nm附近有最大吸收，故选择200 nm为测定波长；其结构中含十八烷氧基，与C18柱固定液结构相似，因此选用C18柱为色谱柱；由于甲醇末端吸收严重，故选用乙腈-水作为流动相，且随着乙腈比例的减小，出峰时间延长，峰展宽严重，乙腈比例过高，主峰与辅料峰又难以达到基线分离，只有当乙腈-水比例为90:10时，既可达到基线分离，又可避免峰展宽。本文建立的测定鲨肝醇片含量的HPLC法，较部颁标准方法结果更接近处方投药量且重复性好。该方法提取完全，操作简便，重复性好，准确度高，可用于鲨肝醇片的质量控制。