昆仑Ⅰ号稀释液中添加恩诺沙星浓度筛选研究

朱文靓，王淼，王杰，崔宝山 ，刘嘉伟，贾小东，高庆华*

（1塔里木大学动物科学与技术学院，新疆 阿拉尔 843300）

（2塔里木大学生命科学与技术学院，新疆 阿拉尔 843300）

（3塔里木畜牧科技兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

精液中细菌会抑制精子运动，降低精子的活力，导致细胞结构异常，影响精液的保存时长，甚至导致细胞凋亡，还可能会使母畜感染生殖系统疾病，威胁到畜群［1-3］。国外学者研究发现细菌会导致精子质量下降，使得精子浓度降低，丧失运动力，精子形态异常，顶体受损等［4］。研究者为了降低精液中细菌造成的危害，通常在稀释液中添加以青链霉素为主的抗生素［5］。青链霉素作为广谱抗生素能够抑制革兰氏阳性菌［6］，但也有研究表明从精液中分离出的细菌对链霉素和青霉素具有耐药性［7］。恩诺沙星是一种杀菌药物，对革兰氏阳性和革兰氏阴性病原菌均有较强的抑制作用，通过阻断DNA复制的旋转酶，破坏细胞核酸合成，迅速杀灭病原菌，优于青链霉素［8-9］。目前，恩诺沙星已用于猪（50 μg/L）［9］、牛（400 μg/mL）［10］、山羊（50 μg/mL）［11］的精液稀释液中，但鲜有绵羊精液稀释液中添加恩诺沙星的相关报道，也没有统一的添加量。本试验室研发的Tris-卵黄专利稀释液（昆仑Ⅰ号稀释液），用于绵羊精液低温保存，能有效保存绵羊精液10 d。因此，本研究将0 μg/mL、25 μg/mL、50 μg/mL、75 μg/mL、100 μg/mL的恩诺沙星分别添加进昆仑Ⅰ号稀释液中，并检测其低温保存绵羊精液的效果，确定恩诺沙星适宜添加剂量，为后期的深入研究奠定基础。

1 材料

1.1 样品及主要试剂

绵羊精液采自塔里木大学动物科学与技术学院实训基地具有正常繁殖能力的3只健康公羊（3～4岁）；Tris、柠檬酸、三磷酸腺苷（ATP）、维生素C、牛血清白蛋白（BSA）购自北京博奥拓达科技有限公司；果糖、海藻糖购自上海源叶生物科技有限公司；恩诺沙星、姬姆萨染液均购自北京索莱宝科技有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、氯化钠购自天津致远化学试剂有限公司；牛肉膏购自北京奥博星生物技术有限责任公司；蛋白胨购自赛默飞世尔科技公司；琼脂粉购自上海山浦化工有限公司。

1.2 主要仪器

超净工作台（SHC-CT-22，上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；荧光倒置显微镜（T1-SM，尼康公司）；电热恒温培养箱（DHP-9272，上海一恒科学仪器有限公司）。

1.3 溶液配制

稀释液配制：按照昆仑Ⅰ号稀释液配方称取，去除稀释液中的青链霉素成分，添加不同浓度的恩诺沙星，用三蒸水溶解，磁力搅拌器搅拌30 min后，分装放入-80℃冰箱避光冷冻保存待用。

福尔马林磷酸盐固定液配制：称取磷酸氢二钠2.25 g、磷酸二氢钠0.55 g，加入30 mL生理盐水，30℃静置3 h溶解，再加入经碳酸镁饱和的甲醛8 mL，用生理盐水定容至100 mL。

姬姆萨染液配制：按照姬姆萨浓缩液与姬姆萨稀释液1:4的比例配制。

培养基的制备：称取牛肉膏2.5 g、蛋白胨5 g、磷酸二氢钾0.5 g、氯化钠2.5 g、琼脂粉10 g放入烧杯中，溶解后用蒸馏水定容至500 mL，过滤、分装入250 mL锥形瓶，并用瓶塞塞住，高压待用。

2 方法

2.1 试验设计

本试验将5个不同浓度的恩诺沙星（E0：0 μg/mL；E25：25 μg/mL；E50：50 μg/mL；E75：75 μg/mL；E100：100 μg/mL）添加于昆仑Ⅰ号稀释液中，在低温保存绵羊精液第0 d，2 d，4 d，6 d，8 d，10 d，12 d时对精子活力、顶体完整率及细菌数进行检测并比较，每个样本检测3次。

2.2 样品采集及稀释保存

使用电刺激采精法进行精液采集，采集的精液放入保温装置中迅速送至试验室。将合格的精液按适宜的稀释比例稀释后，在2 h内缓慢降至0℃，并保存在冰水混合物中。

2.3 精液品质检测

精子活力检测：将保存的精液轻轻混匀，吸取10 μL精液滴于载玻片上，盖上盖玻片，置于37℃载物台上，在400倍视野下观察并计数。

精子顶体完整率检测：将保存的精液轻轻混匀，吸取10 μL精液滴于载玻片上，用另一洁净载玻片将其制成抹片，自然风干，用福尔马林磷酸盐固定液固定15 min，蒸馏水冲洗，自然风干，姬姆萨染液染色90 min，蒸馏水冲洗，干燥待检。

精液细菌数检测：将保存的精液轻轻混匀，吸取100 μL精液于生理盐水中稀释至20倍待用，在超净工作台中的酒精灯火焰旁操作，每个培养皿中倒入15 mL左右培养基，在培养基未凝固时加入100 μL稀释后的精液，混匀，凝固后放入37℃培养箱中倒置培养48 h。

2.4 数据统计与分析

数据使用SPSS 17.0统计软件进行单因素方差分析，结果用“平均值±标准差”表示。P>0.05表示差异不显著，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

3 结果

3.1 添加恩诺沙星稀释液低温保存的绵羊精子活力

如表1所示，随着低温保存时间的增长，精子活力逐渐下降；E75组精子在低温保存至12 d时精子活力达到50%以上，且E75组精子活力在每一天均高于其余4组，从第8 d开始极显著高于其余4组（P<0.01）；E0组精子活力除第0 d外，均低于其余4组，从第6 d开始极显著低于E50组和E75组（P<0.01）。

表1 低温保存绵羊精液不同时间的精子活力 %

3.2 添加恩诺沙星稀释液低温保存的绵羊精子顶体完整率

精子顶体完整效果见图1，精子顶体完整率变化情况见表2。由表2可见，5组添加不同浓度恩诺沙星的稀释液低温保存绵羊精液随着低温保存时间的增长，精子的顶体完整率呈现不断下降的趋势；从第6 d开始E0组精子顶体完整率显著低于其余4组（P<0.05）；E75组精子顶体完整率仅在第10 d显著高于其余4组（P<0.05），其他天数均与E25、E50、E100组差异不显著（P>0.05）。

表2 低温保存绵羊精液不同时间的精子顶体完整率 %%

图1 精子顶体完整效果图（400×）

3.3 添加恩诺沙星稀释液低温保存绵羊精液的细菌数

如图2所示，E0组稀释液低温保存绵羊精液的细菌总数随着保存时间的增加逐渐增加，其余4组细菌数总体呈现先下降后上升的趋势，但5组精液的细菌菌落数均在国家标准范围内；E0组精液细菌菌落数从第4 d开始极显著高于其余4组（P<0.01）。

图2 低温保存绵羊精液不同时间的细菌数

4 讨论

本试验是在昆仑Ⅰ号稀释液中添加5组不同浓度的恩诺沙星低温保存绵羊精液，分别在不同天数检测精子活力、顶体完整率及细菌数。从试验结果可以看出，随着低温保存时间的增长，精子活力与顶体完整率呈现逐渐下降趋势，E75组精子活力在低温保存至12 d时仍能达到国家鲜精输精标准，5组精液的细菌数均在国家标准范围内。

恩诺沙星对革兰氏阳性和革兰氏阴性病原菌都具有抗菌活性，对广谱需氧菌和一些兼性厌氧菌具有杀菌作用［10］，并且恩诺沙星对于精液中的大肠杆菌具有良好的抗菌能力［9］。有研究表明恩诺沙星具有药效稳定、迅速灭菌、无毒的优点［8］。从本试验结果可以看出5组稀释液低温保存绵羊精液精子活力随着保存时间的增长而下降，E0组精子活力在第8 d就已降至50%以下，这可能是因为E0组稀释液中并未添加任何抗生素，精液中细菌增多，细菌可能会与精子竞争，导致精子能量耗竭，降低了精子的活力，这与AKHTER S等［12］研究结果相似；E50组精子活力在10 d内能达到国家鲜精输精标准，与王杰等［13-14］、赵建清等［15］的研究结果相符；添加75 μg/mL恩诺沙星稀释液组（E75）精子活力能在12 d内达到50%以上，而添加100 μg/mL恩诺沙星稀释液组精子活力在第10 d就已降到45%，这说明稀释液中添加适当浓度的抗生素能够抑制精液中微生物的生长和繁殖，从而延长精液保存时间，改善保存精液的品质［16］，且稀释液中抗生素的添加剂量必须有一定的限度。有研究表明精液中含有大肠杆菌会损害精子顶体，而本次试验发现E0组精子从第6 d开始顶体完整率显著低于其余四组（P<0.05），这可能是因为E0组稀释液未添加恩诺沙星，而恩诺沙星能够抑制大肠杆菌的生长［9］，ANDRABI S M等［17］发现添加适当恩诺沙星的稀释液保存精子会使精子顶体完整性更高，这与本试验发现稀释液中添加75 μg/mL恩诺沙星低温保存绵羊精液精子顶体完整率高于其余4组的结果相似。

我国国家标准GB/4143—2008《牛冷冻精液》中明确规定，每剂量牛冷冻精液中细菌数最多不得超过1 000个［18］，GB/20557—2006《山羊冷冻精液》中规定，山羊冷冻精液细菌数不得超过800个［19］，在本试验中，5组稀释液低温保存绵羊精液细菌数在12 d内均符合国家标准所规定范围；ZHANG J等［20］研究发现精液可能会在精液采集和加工储存过程中被细菌污染，精液中存在细菌会对精液质量和生育力有负面影响，本试验中添加恩诺沙星的处理组随低温保存时间的增长细菌数呈现先下降后上升的趋势，细菌数上升，精子活力下降，这与WANG H等［21］研究结果相一致。E0组精液稀释液低温保存绵羊精液细菌数除第1 d外均高于其余4组，从第4 d开始极显著高于其余4组，这是因为E0组稀释液中并未添加恩诺沙星，而恩诺沙星能够通过抑制DNA的合成从而对广泛的病原菌具有杀菌作用，对革兰氏阳性病原菌与革兰氏阴性病原菌均有杀菌作用［22］；本试验结果表明添加75 μg/mL恩诺沙星的昆仑Ⅰ号稀释液低温保存绵羊精液的效果较优，与茆达干等［11］研究发现在稀释液中添加50 μg/mL恩诺沙星低温保存波尔山羊精液效果较好的结果不同，可能是因为稀释液成分不一致，并且其并未对恩诺沙星的添加剂量进行筛选。本试验确定了恩诺沙星适宜添加剂量，为后续研究卵黄稀释液中添加恩诺沙星低温保存绵羊精子效果研究奠定一定基础。

5 结论

本试验在昆仑Ⅰ号稀释液中添加75 μg/mL恩诺沙星低温保存绵羊精液效果最优，精子活力在第12 d仍能达到50%以上，可对绵羊精液进行低温长效保存。