基于形态和分子系统学对荒漠生羊肚菌的鉴定

赵振西，杨梅，王国庆，夏占峰，徐彪 *

（1塔里木大学生命科学与技术学院/塔里木盆地生物资源保护利用兵团重点实验室，新疆 阿拉尔 843300）

（2阿克苏地区林业发展保障中心，新疆 阿克苏 843006）

（3托木尔峰国家级自然保护区管理局，新疆 阿克苏 843006）

（4仲恺农业工程学院植物健康创新研究院，广东 广州 510225）

羊肚菌（Morchella），隶属子囊菌门（Ascomycota）、盘菌纲（Pezizomycetes）、盘菌目（Pezizales）、羊肚菌科（Morchellasceae）。因菌盖多为不规则且呈蜂窝状，形态酷似羊肚，故称羊肚菌［1］。其肉质脆嫩可口，风味独特，富含大量人体必需氨基酸、多种维生素和矿质元素，是一种世界公认的珍贵、稀有食用菌［2］。在欧洲，羊肚菌被认为是仅次于块菌的美味食用菌；北美人则将其作为食用菌中的佳品；在我国除作为食用菌品种外，《本草纲目》中曾有记载“甘寒无毒，益肠胃，化痰利气”的药用功效［3］。其食药用价值在国内外备受追捧，市场需求量日益增加。近年来，虽然人工栽培羊肚菌的技术得到突破，市场前景被业内广泛关注，然而，人工栽培产量不稳定是当前制约羊肚菌产业发展的重要瓶颈［4-5］。如何科学开发、利用和保护野生资源，寻找优良易于栽培的品种，是一个亟待解决的问题。

新疆地处我国西北干旱区，分布着大量独特的生物资源，已经报道的野生羊肚菌有：黑脉羊肚菌（M.angusticeps）、高羊肚菌(M.elata)、小羊肚菌（M.deliciosa）、尖顶羊肚菌（M.conica）、粗柄羊肚菌(M.crassipes)、羊肚菌(M.esculenta)、半开羊肚菌(M.semilibera)等［6-9］，大多分布在乌鲁木齐、伊犁、石河子、阿勒泰等北疆林带中［10-15］。然而，南疆地区作为新疆主要地区之一，其野生羊肚菌资源的种类、数量以及生境的调查研究却很少。

2018年4—5月期间，在新疆阿拉尔地区部分荒漠果园中发现野生羊肚菌，其分布于荒漠生境较为罕见。为明确该物种的分类地位，本研究通过形态学特征观测，联合ITS-LSU-rpb1-rpb2-ef1-α基因序列分析，对采自新疆南疆荒漠地区野生羊肚菌进行鉴定，以明确该物种的分类地位和生态分布，为开发利用本地资源提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试野生羊肚菌于2018年4—5月采集于新疆阿拉尔荒漠苹果园（81°17′19″E，40°32′46″N），凭证标本保藏于塔里木大学菌物标本馆（HMUT 7691，HMUT 7692）。

1.2 实验方法

1.2.1 形态观测

对荒漠果园野生羊肚菌进行现场拍照，观察、记录并测量新鲜子实体具有分类价值的结构［16］。用3%的KOH溶液作为浮载剂，对干燥标本进行徒手切片［17］，使用显微镜（Nikon ni-E，Nikon，Japan）观测其微观形态特征（包括子囊、孢子等）。

1.2.2 DNA的提取

用无菌刀片切取约50～100 mg子实体的内部组织，置于灭菌的1.5 mL离心管，加入2～3粒3.5 mm大的无菌钢珠，经MP Fastprep-24样本制备系统（MP Biomedicals，USA）组织粉碎，采用E.Z.N.A.TM Fungal Mini Kit试剂盒（OMEGA Biotek，USA），按照试剂盒操作说明提取DNA，基因组DNA经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，置-20℃的冰箱内保存备用。

1.2.3 PCR扩增及检测

PCR扩增采用25 μL体系，其中2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，引物各 1 μL（10 μmol/L），DNA 模板1 μL，用ddH2O补齐。5个标记基因序列扩增引物（如表1所示）。ITS序列PCR扩增反应程序为：95℃预变性3 min；94℃变性40 s，54℃退火45 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min。LSU序列PCR扩增反应程序为：94℃预变性1 min；94℃变性30 s，50℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，35个循环；72 ℃延伸10 min［18］。rpb1、rpb2和ef1-α序列的PCR反应程序为：94℃预变性3 min；94℃变性1 min，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；72℃延伸10 min［19］。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带送往上海生物工程有限公司进行正反向测序。

表1 PCR和扩增引物

1.2.4 系统发育分析

供试样本测序获得的序列，使用Seqman v.7.l.0软件分别进行拼接和校准后提交至GeneBank，并在NCBI中进行Blast比对分析选用序列（如表2所示）；以变红羊肚菌（Morchella rufobrunnea）为构建系统发育树的外群；使用MAFFT v.7.47进行多序列比对，经PhyloSuite.v.1.1.14软件进行联排，获得5个基因的联合矩阵；联合矩阵提交至CIPRES在线服务平台（https://www.phylo.org），经Mrmodeltest 2.3［23］选择最佳模型，使用 RAxML-HPC2 on XSEDE（8.2.12）［24］和MrBayes on XSEDE（3.2.7a）［25］分别构建系统发育树。系统发育树使用FigTree 1.4.3查看编辑。

表2 本研究中的参考样本及5个基因的登录号

续表2

2 结果与分析

2.1 分子系统发育分析

供试样本经测序，所得基因序列长度分别为ITS：1 036 bp，LSU：1 023 bp，rpb1：757 bp，rpb2：725 bp，ef1-α：1 013 bp（如图1所示）。基于 ITS-LSU-rpb1-rpb2-ef1-α联合矩阵，采用最大似然法和贝叶斯法构建的系统发育树，其拓扑学结构一致（如图2所示），供试样本属黄色羊肚菌支系（Esculenta Clade），与泛美羊肚菌（Morchella americana）聚为同一支，支持率为97%/1.00（ML/BI）。

图1 泛美羊肚菌(Morchella americana)基因组DNA ITSLSU-rpb1-rpb2-ef1-α序列扩增结果

图2 基于ITS-LSU-rpb1-rpb2-ef1-α联合矩阵采用最大似然法和贝叶斯法构建的系统发育树

2.2 形态描述

子实体中等，菌盖长4～8 cm，宽3～6.5 cm，常见卵圆形至近球形，顶端凸出或呈钝锥形，偶见近圆形，表面多凹坑，且不规则，灰棕色至棕黄色。菌柄长5～10 cm，宽2～5 cm，常见棍棒状或近棍棒状，白色至淡黄色，表面分布白色或淡黄色颗粒，中空，基部膨大，并有显著的粗凸隆起（如图3A、3B所示）。子囊孢子椭圆形，表面光滑，透明，无油滴；子囊圆柱形，透明，常见8个孢子（如图3C、3D所示）。

图3 供试样本形态观察

3 讨论

Morchella americana是世界分布较为广泛的种［26-27］，由于分类标准的不统一，同一物种在不同地区常赋予不同名称，同物异名现象普遍。在北美，KUO M等［28］曾以M.esculentoides对其报道；在欧洲，CLOWEZ P 等［29］以 M.rigida进行描述，而KELLNER 等［30］则将其记载为 M.esculenta；基于LSU、rpb1、rpb2和ef1-α这4个基因的核苷酸序列，O’DONNELL K等［31］利用多基因谱系一致性系统发育学物种识别法（GCPSR），将羊肚菌属划分为黄色羊肚菌支系（Esculenta Clade）、黑色羊肚菌支系（Elata Clade）和变红羊肚菌支系（Rufobrunnea Clade），并采用了类群缩写+数字的方法来命名Esculenta支系（如Mes-n）和Elata支系（如Mel-n）。DU X H等［27,32］对中国各地区采集的M.esculenta和M.esculentoides样本进行研究并对其物种名称进行了规范。本研究综合形态特征和多基因系统发育分析，明确分布于荒漠生境中的野生羊肚菌与O’DONNELL P等［31］报道的系统发育种Mes-4一致，但子实体较其偏小，菌盖近球形居多，成熟时颜色呈黄色或浅灰色，有时菌盖边缘出现浅红色至红棕色；菌柄基部膨大，且脊凸起显著。

目前，已记载M.americana的生境主要分布于榆树林、杨树林、河岸旁或林地火烧地中，偶有发生在针叶林内［28-30,32］，而分布于荒漠生境则未见报道。M.americana在荒漠生境中分布，进一步表明该种的生态适应性强或可能是长期适应性进化的结果。利用该种在特殊生境的适应性，可为开发利用本地野生羊肚菌资源进行人工栽培提供重要的指导。