MIL-101(Cr)-表面辅助激光解吸电离-质谱法快速检测血样中的芦丁

王静楠， 王丽丽， 胡 筱*， 林 晓， 林 浦， 陈昌梅， 余丽双*

(1.福建中医药大学药学院，福建福州 350122；2.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州 350122；3.福建省茶叶质量检测与技术推广中心，福建福州 350001)

近年来，基质辅助激光解吸电离质谱(Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Mass Spectrometry，MALDI-MS)成为分析多肽、蛋白质、聚合物、多糖等大分子不可或缺的分析工具。在MALDI技术中，α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)、芥子酸(SA)等有机基质实现了较高的解吸和电离效率。但由于有机基质的自身离子化造成了质谱图中小于700 Da的低质量端严重的背景干扰，从而影响小分子化合物的检测。因此，有研究者在MALDI原理的基础上提出了表面辅助激光解吸电离-质谱(Surface -Assisted Laser Desorption Ionization-Mass Spectrometry,SALDI-MS)，该方法能够将MALDI-MS的应用范围扩大，使其在检测小分子物质时降低了干扰，提高了检测灵敏度[1]。

金属有机骨架(Metal Organic Frameworks，MOFs)是一种多孔的晶体材料[2]，由于它们独特的性质，如大比表面积、超高孔隙率、多样化功能以及良好的化学稳定性等优点，MOFs在生物领域中的应用得到了广泛的研究，特别是在蛋白质组学和肽类研究的样品制备中[3]。随着MOFs材料和后修饰技术的发展，用作SALDI-MS基质的MOFs种类及可分析化合物的种类明显增多，通过与功能性材料复合或修饰特定的官能团，MOFs材料可以兼具基质和富集两种功能[4]。Lin等人[5]利用磁性ZIF-8纳米材料作为MALDI的基质实现了对脂肪酸、多肽、性激素等一系列小分子化合物的分析；Chen等人[6]合成了两种新的材料UiO-66-PDC和UiO-66-(OH)2作为基质对磷酸吡哆醛和葡萄糖进行分析。因此，将MOFs材料作为基质用于SALDI-MS，可实现其快速检测复杂样品中的小分子化合物。

小分子黄酮类药物的分子量大部分小于700 Da，在MALDI-MS分析中，使用传统基质在低质量端会造成严重的背景干扰，故要实现黄酮类小分子的MALDI-MS分析十分困难。本文将金属有机骨架化合物MIL-101(Cr)材料用做SALDI的基质，选择黄酮类化合物作为分析对象，并对比考察了MIL-101(Cr)与传统基质的检测效果。从结果上来看，MIL-101(Cr)在检测黄酮类化合物方面与传统基质相比表现出更有利的优势，可以增强待测样品离子信号强度，实现对黄酮类小分子的无背景干扰检测。因此基于MIL-101(Cr)对芦丁的吸附富集及对生物大分子的排除，可以实现血样中芦丁的分析。

1 实验部分

1.1 主要实验仪器

UV-1800型紫外-可见分光光度计(日本，岛津公司)；Vortex QL-861型漩涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造(中国)有限公司)；KQ-300DE型超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司)；Autoflex Speed基质辅助激光解析电离-时间分辨质谱(德国，布鲁克道尔顿)，仪器参数：激光光源为smartbeam-Ⅱ激光器，激光波长为355 nm，频率为500 Hz。

1.2 材料与试剂

MIL-101(Cr)(CAS：869288-09-5；BN：CS016024)购于上海楷树化学科技有限公司；芦丁标准品(ID：XW37-4SPD，91.9%)、橙皮苷标准品(ID：ZZ3A-1SC5，95.1%)购于中国药品生物制品检定所；5-O-甲基维斯阿米醇苷标准品(CAS：84272-85-5，98%)、黄芩苷标准品(CAS：21967-41-9，98%)购于上海源叶生物科技有限公司；三氟乙酸(TFA，99%)购自Sigma-Aldrich公司；乙腈(99.5%)购于默克化工技术(上海)有限公司；α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)、芥子酸(SA)购自布鲁克公司。水为去离子水。

1.3 实验方法

1.3.1 标准溶液的配制准确称量1.00 mg的黄酮类化合物粉末，用70%的乙腈配制成1.00 mg/mL，其他浓度溶液通过对原溶液进行逐级稀释得到。配制好的标准品溶液保存在4 ℃条件下，备用。

1.3.2 基质溶液的配制称取HCCA和SA各10 mg，分别溶解在1 mL的AT50溶液(0.1%TFA溶液和乙腈1∶1混合)中；称取MIL-101(Cr) 5 mg，溶于1 mL去离子水，并将以上基质溶液超声处理10 min。其他浓度的基质溶液通过逐级稀释获得。

1.3.3 点样方法分层点样法：首先将1 μL的基质溶液滴在靶板上，之后在室温下干燥，然后再将1 μL的待测样品溶液滴在基质上面，再于室温下干燥。混合点样法：将1 μL的基质溶液与1 μL的待测样品溶液混合后，取1 μL点在靶板上。

1.3.4 样品的制备取新鲜小鼠血浆200 μL与200 μL 70%的乙腈混合，配制成50%的血浆，精密称取芦丁5.00 mg并用1 mL 70%乙腈溶解配制成5 mg/mL，用50%血浆将5 mg/mL的芦丁稀释成1 mg/mL。

2 结果与讨论

2.1 MIL-101(Cr)用作SALDI-MS基质性质的考察

MIL-101(Cr)用于质谱基质与传统基质的对比如图1所示。传统基质HCCA和SA，由于在激光轰击下其自身的解离，在低的质荷比范围内产生许多背景信号峰。而MIL-101(Cr)作为固体基质时，在低质荷比范围内观察不到有其自身信号出现，在对小分子化合物进行检测时，可以有效地避免背景干扰，实验结果表明MIL-101(Cr)可用于SALDI的基质分析低分子量化合物。

在样品浓度为1 mg/mL的条件下，以MIL-101(Cr)作为质谱基质，考察了4种黄酮类物质在正离子模式下的检测效果，如图2所示。实验结果显示，黄酮苷类物质在激光作用下容易分裂成糖和黄酮苷元(*表示)。在正离子模式下，我们分别测到了4种苷类在激光下，普遍出现[M+Na]+、[M+Cr-2H]+形式的衍生离子信号，而4种苷类裂解成的苷元则容易出现[2M+Cr-2H]+形式的衍生离子信号。

使用传统基质对待测样品进行离子化时，仅仅在基质与分析物共结晶的某一位置处，才能测到最佳的SALDI-MS信号。但对于MIL-101(Cr)而言，由于均匀的分散性，所以其克服了不同位置信号强度不同的缺点。如图2所示，利用传统基质HCCA和SA分别与MIL-101(Cr)作为基质对4种黄酮苷类化合物5-O -甲基维斯阿米醇苷、橙皮苷、芦丁和黄芩苷进行对比分析检测。通过对比分析发现，使用MIL-101(Cr)作为新的基质背景清晰，无自身的干扰峰出现。与HCCA相比，MIL-101(Cr)能够增强5-O -甲基维斯阿米醇苷、芦丁的信号值；与SA相比，MIL-101(Cr)能够增强橙皮苷、芦丁和黄芩苷的信号值，且对芦丁的检测具有较强的增敏效果。故后续实验将开展MIL-101(Cr)-SALDI-MS快速检测芦丁的研究。

图2 HCCA、SA和MIL-101(Cr)基质检测黄酮类物质质谱对比图(样品分别为5-O -甲基维斯阿米醇苷、橙皮苷、芦丁和黄芩苷；浓度1 mg/mL；激光强度70%；*表示对应的黄酮苷元)

2.2 芦丁检测条件的优化

图3 (a)不同浓度MIL-101(Cr)基质检测1 mg/mL芦丁质谱对比图；(b、c、d、e、f) MIL-101(Cr)对不同浓度芦丁的富集效果(芦丁浓度：b.1 mg/mL；c.500 μg/mL；d.100 μg/mL；e.50 μg/mL；f.1 μg/mL，MIL-101(Cr)浓度为0.5 mg/mL)

此外，不同的点样方法对检测也有影响。如图4(a)所示，分层点样方法测到的芦丁[M+Na]+的m/z633 (*表示)质谱峰信噪比为666.5，而混合点样法的质谱峰信噪比为48。分层点样方法测到的芦丁的黄酮苷元[2M+Cr-2H]+的m/z655(•表示)质谱峰信噪比为1812，而混合点样法的质谱峰信噪比为510。因此，在基质点样方法中，分层点样法对芦丁的检测效果最好。主要的原因可能是混合点样会包埋很大一部分样品，从而不能使其离子化，影响检测效果。

2.3 血浆样品中芦丁的检测

我们在小鼠复杂的血浆中加入芦丁标准品对其进行定性分析。如图4(b)所示，在3种不同的基质下小鼠血浆中的芦丁被成功地鉴定，其中我们非常明显检测到了m/z633.319的信号峰，为芦丁[M+Na]+离子化形式(•表示)。因此，证实MIL-101(Cr)作为SALDI基质的实际应用价值。

图4 (a)样品制备方法对芦丁检测的影响(芦丁浓度1 mg/mL)；(b)MIL-101(Cr)基质和传统有机基质检测血浆中1 mg/mL芦丁质谱图(HCCA、SA和MIL-101(Cr)浓度均为1 mg/mL；激光强度70%)

2.4 MIL-101(Cr)作为芦丁检测基质的反应机理

芦丁属于黄酮醇配糖体，可分为片段A黄酮和片段B双糖分别与MIL-101(Cr)反应(图5(a))。推测片段A黄酮中有三个结合位点可能会与MIL-101(Cr)发生交换反应，与Cr结合。具体位点在3-羟基-4-酮、5-羟基-4-酮和3′,4′-二羟基。有研究表明黄酮类化合物-槲皮素可以与Al3+发生配位反应[10]。有文献表明片段B双糖中羟基可与对苯二甲酸中羧基发生酯化反应，这也进一步说明了MIL-101(Cr)能够与芦丁发生反应，并实现牢固结合。并且芦丁最大吸收波长与和MIL-101(Cr)的吸收波长靠近激光光源的波长(355 nm)(图5(b))，这也有助于芦丁的解析-电离过程。

图5 (a)芦丁的结构式；(b)MIL-101(Cr)和芦丁的的紫外-可见吸收光谱图

3 结论

利用MIL-101(Cr)做SALDI的基质，实现了对黄酮类药物小分子的无背景干扰检测。由于具有π共轭结构，配位不饱和位点和紫外-可见光强吸收特性，MIL-101(Cr)在小分子检测方面表现出许多优点。对于已知结构的4种黄酮类化合物，由于芦丁中黄酮片段和双糖片段都能与MIL-101(Cr)发生反应，且芦丁的最大吸收波长与MIL-101(Cr)相匹配，并据此建立了芦丁的分析方法。本文通过方法验证，基于MIL-101(Cr)对于芦丁的吸附富集及对生物样品中内源性大分子的排除，可以实现血样中芦丁的分析。