红景天苷抑制卵巢癌细胞SKOV3增殖的基因水平研究

袁肇方，时小凤，张向博,2，白生菊，巩转娣，魏锁成,2

(1.西北民族大学 生物医学研究中心，甘肃 兰州 730030；2.西北民族大学 生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730030； 3.西北民族大学 医院，甘肃 兰州 730030)

0 引言

卵巢癌也称卵巢恶性肿瘤，是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一[1].上皮性卵巢癌约占所有卵巢恶性肿瘤的90%，死亡率居各类妇科肿瘤的首位，严重威胁着广大妇女的生命健康安全.因为卵巢恶性肿瘤的发病机理有许多种原因，因此在治疗方法上也有所不同.目前，大多数治疗方案采用手术治疗和化疗药物治疗联合进行.虽然使用化学药物进行治疗的作用机理明了，其疗效也非常显著，但是化学药物具有一定的毒性，而且长期使用还容易产生耐药性，因此在临床治疗上需要毒性较小并且疗效显著的药物，而中药相对于化学药物具有明显的优点.近年来发现多种中药材，如大黄、红花、雷公藤、厚朴、黄连和丹参等，可以通过不同的作用机理应用于卵巢癌的治疗中.

红景天为景天科红景天属的多年生草本植物，多分布在高寒地带[2]，如四川和西藏地区.红景天苷作为红景天的有效活性成分之一，具有抗肿瘤、抗疲劳、抗辐射、抗病毒、抗衰老和免疫调节等多种功效[3].红景天苷对肺癌、肝癌、乳腺癌、胃癌和宫颈癌等均有显著的抑制效果[4].

磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)是一种同时具有脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶活性的抑癌因子.20%的透明细胞癌和15%左右的卵巢子宫内膜样腺癌中可发现PTEN基因的缺失[5-7].

PTEN是一类抑癌基因，其在多种癌症中都呈低表达状态，上调PTEN表达可减缓癌症的发展[8].本实验对红景天苷抑制卵巢癌的增殖作用与PTEN的关系进行研究，从而为红景天苷应用于临床治疗提供实验依据.

1 材料

1.1 药物与试剂

红景天苷；McCoy，s5A培养基；胎牛血清；CCK-8细胞增殖检测试剂盒；AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡试剂盒、细胞周期试剂盒；磷酸酶-张力蛋白基因(PTEN)一抗；BCA蛋白定量试剂盒；RNA提取液.

1.2 主要仪器

CO2培养箱，超低温冰箱，荧光定量PCR仪及化学发光仪，低温高速离心机，倒置显微镜.

1.3 细胞株

人卵巢癌细胞株SKOV3，置于25cm2培养瓶贴壁生长.

2 方法

2.1 细胞培养

使用含10%灭活的胎牛血清和1%双抗(青霉素/链霉素)的McCoy，s5A培养基培养人卵巢癌细胞SKOV3，于5%CO2、37℃恒温恒湿细胞培养箱中培养.2～3天用0.25%胰酶消化，进行传代.

2.2 药物处理及分组

将对数生长期SKOV3细胞于37℃、5% CO2培养箱中培养24 h，实验组分为五组，分别为SAL-1组(4 μmol/mL)、SAL-2组(8 μmol/mL)、SAL-3组(16 μmol/mL)、SAL-4组(30 μmol/mL)和SAL-5组(40 μmol/mL),对照组(CG)为空白对照，继续培养24 h、48 h和72 h.

2.3 CCK-8法检测细胞增殖

取处于对数生长期的卵巢癌细胞消化离心，以每孔5×104个细胞均匀接种至96孔培养板中，在培养基中加入4、8、16、30和40 μmol/mL浓度的红景天苷处理SKOV3细胞，继续培养24 h、48 h和72 h，每组设置5个副孔.分别在24 h、48 h和72 h，每孔加10 μL CCK-8溶液，以加入等体积的PBS作为空白对照，置于37℃培养箱中温育3 h，用多功能酶标仪测定450 nm处的吸光度(OD)值，计算不同时间不同浓度红景天苷对卵巢癌细胞SKOV3增殖的抑制率.

2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期

取细胞密度长至90%的6孔板，按浓度为8、16、30和40 μmol/mL的红景天苷加药48 h后用胰酶(不含EDTA)消化收集细胞，1000 g离心5 min，弃上清，PBS重悬，1000 g离心5 min，弃上清，加入500μl结合液轻轻重悬，加入5 μl Annexin V-FITC轻轻混匀，再加入10 μl PI混匀，室温避光孵育30 min，流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期，使用FlowJo进行数据分析.

2.5 PTEN mRNA表达检测

Real-time PCR样本收集方法按照传统RNA抽提方式进行，各组细胞中加入1mlTrizol后加入200 μl氯仿混匀后静置10 min,4°C，12000 r/min离心15 min,将上层的水箱转移至新的无RNase的EP管,加入500 μl异丙醇,混匀,静置10 min后12000 r/min离心10 min,弃上清,可见白色RNA沉淀于管底,75%乙醇清洗后晾干，待RNA沉淀变为无色透明状,加入30 μlDEPC水溶解RNA,储存于-80℃.使用hieff UNICONqPCR SYBR Green Master Mix(抗体法，No Rox)试剂盒进行基因的定量PCR检测，采用20 μl的反应体系，95 ℃预变性30s后95 ℃10 s，60 ℃30 s进行 40个循环，反应结束后确认扩增曲线和融解曲线，依据公式 2-ΔΔCT计算被检测基因的相对量，引物序列如表1所示.

表1 引物序列

2.6 PTEN蛋白表达

采用Western blot方法收集各组SKOV3细胞于离心管中，加入RIPA裂解液，电动匀浆器进行裂解，BCA 蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度.上样量为20 μL蛋白质，通过10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，转印至PVDF膜上，用PBS清洗PVDF膜5 min，加入5%脱脂奶粉封闭2 h.加入一抗(PTEN、GAPDH)4 ℃孵育过夜.加入二抗(1∶2500)，37 °C孵育1 h.二抗孵育后使用ECL发光液处理，在暗室中进行曝光拍照.每组实验重复3次，使用Image 软件分析各条带灰度值.

3 结果

3.1 卵巢癌SKOV3细胞的形态学变化

红景天苷作用于卵巢癌细胞SKOV3 24 h、48 h和72 h细胞形态的改变可见图1-1、图1-2和图1-3.对照组(CG)中的SKOV3细胞生长良好，增殖旺盛，并在它们之间紧密相连(见图1).与CG相比，实验组SKOV3细胞的增殖活力逐渐减弱，随着红景天苷浓度从SAL-1组增加到SAL-5组，细胞分裂随着死亡细胞的增加而减少.SKOV3细胞的数量在48 h和72 h时也有所减少.当红景天苷浓度达到30 μmol/mL(SAL-4组)和40 μmol/mL(SAL-5组)时，大量SKOV3细胞变成卵形和梭形.72 h时，红景天苷所有处理组的SKOV3细胞数量明显低于24 h和48 h.这些结果表明，随着培养时间的延长，SKOV3细胞的生长逐渐变得迟缓.

注：字母A、B、C、D、E、F分别代表对照组(CG)、SAL-1、SAL-2、SAL-3、SAL-4和SAL-5组.

3.2 红景天苷对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响

CCK-8检测发现红景天苷对卵巢癌细胞SKOV3的抑制率随着浓度的增加逐渐升高，如图2所示.在24 h、48 h和72 h实验组中，SAL-2组和SAL-3组的抑制率显著高于CG组(P<0.05)，SAL-4组和SAL-5组的抑制率极显著高于CG组(P<0.01).

3.3 红景天苷对卵巢癌SKOV3细胞周期的影响

以不同浓度红景天苷(4、8、16、30和40 μmol/mL)处理SKOV3细胞48 h后，细胞周期结果分析如图3所示.随着红景天苷浓度的增加，G0/G1期细胞比例逐渐增加，SAL-3组显著高于CG组(P<0.05)，SAL-4和SAL-5极显著高于CG组(P<0.01)，SAL-5极显著高于SAL-2组(P<0.01)；S期细胞比例逐渐减少；G2/M期的细胞比例无统计学差异.结果显示，红景天苷对卵巢癌细胞SKOV3的阻滞期为G0/G1期.

注：*P<0.05与CG组比较；##P<0.01与SAL-1组比较.

注：*P<0.05与CG组比较；**P<0.01与CG组比较；##P<0.01与SAL-2组比较.

3.4 红景天苷对卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响

凋亡率结果显示，红景天苷增大了SKOV3细胞的体外凋亡率.随着红景天苷浓度的增加SKOV3细胞的凋亡率也在增大(见图4).SAL-5组在24 h、48 h和72 h时，SKOV3细胞的凋亡率均显著高于对照组(CG)和SAL-1组(P<0.05或P<0.01).结果表明，高剂量的红景天苷可显著促进SKOV3细胞的凋亡.

注：*P<0.05与CG组比较；#P<0.05与SAL-1组比较；##P<0.01与SAL-1组比较.

3.5 SKOV3细胞中PTEN mRNA的表达水平

随着时间的延长和剂量的增加，PTEN mRNA的表达水平也逐渐呈依赖性的增加(见图5).在24 h、48 h和72 h时，SAL-5组的PTEN mRNA相对表达量增幅最大，且SAL-5组极显著高于CG组和SAL-1组(P<0.01).研究结果表明，红景天苷呈剂量依赖性地改变SKOV3细胞中PTEN mRNA的相对表达，而较高剂量的红景天苷可提高SKOV3细胞中PTEN mRNA的表达水平.

注：*P<0.05与CG组比较；**P<0.01与CG组比较；#P<0.05与SAL-1组比较；##P<0.01与SAL-1组比较.

3.6 SKOV3细胞中PTEN蛋白的影响

与CG相比，随着红景天苷剂量从4～40μmol/mL的增加，PTEN蛋白的表达水平逐渐升高(图6).在24 h、48 h和72 h时，SAL-5组PTEN蛋白的表达水平极显著高于CG组和SAL-1组(P<0.01)，且SAL-5组PTEN蛋白表达水平最高.实验结果表明，高浓度的红景天苷可以提高SKOV3细胞中PTEN蛋白的表达水平.

注：*P<0.05与CG组比较；**P<0.01与CG组比较；#P<0.05与SAL-1组比较；##P<0.01与SAL-1组比较.

4 讨论

中药已广泛应用于肿瘤的临床治疗,在抑制肿瘤发展、减轻肿瘤患者病痛、提高其免疫功能、延长患者寿命等方面发挥重要作用[3].红景天苷是从红景天、大花红景天以及高山红景天中提取的一种酚类活性物质.红景天苷主要的药理作用有抗衰老、抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳、增强免疫力以及清除自由基等[9]，也有健脾益肺、活血化瘀的功效.近年来，多项研究表明红景天苷具有抗肿瘤的作用，其可阻滞癌细胞的周期，诱导癌细胞的凋亡、分化和自噬，在多种癌症治疗中发挥着重要作用[10-14].

本研究发现红景天苷能够抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖，其抑制率与红景天苷浓度成正相关.随着药物作用时间的延长，SKOV3的存活率下降，浓度为40 μmol/mL的红景天苷作用效果最显著.

磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)是公认的肿瘤抑制因子,它的突变与缺失和多种癌症的发生发展有关.PTEN是PI3K/Akt通路上游因子之一,是该条通路关键的负调控基因[15].PTEN能够对PI3K进行负反馈调节,PI3K/Akt信号转导途径中的第二信号磷脂酰肌醇-3-磷脂(PIP3)去磷酸化变成磷脂酰肌醇-2-磷酸(PIP2)失去激活Akt的作用，从而抑制PI3K/Akt信号通路发挥作用.当PTEN出现缺失或突变可能会导致PI3K/Akt信号通路的激活[16-18].对细胞生长、凋亡、增殖及黏附产生影响.近年来的研究成果已经证实,PTEN与子宫内膜癌﹑卵巢癌、宫颈癌等多种妇科肿瘤的发生发展密切相关[19-20].本研究实验结果显示，不同时间不同浓度的红景天苷干预SKOV3细胞后，PTEN mRNA和蛋白的表达量随着红景天苷浓度的递增而升高.

结合CCK-8和流式细胞仪实验数据显示，随着红景天苷浓度的增加，卵巢癌细胞SKOV3的抑制率逐渐增加，作用时间越长，其抑制率越高，半数抑制浓度越低.高浓度红景天苷处理组的细胞凋亡率显著高于对照组，结果表明高浓度红景天苷可促进卵巢癌细胞SKOV3的凋亡.红景天苷处理组G0/G1期细胞比例显著多于对照组，因此表明红景天苷将SKOV3细胞阻滞于G0/G1期.PTEN基因与蛋白表达水平的变化表明红景天苷可能通过调控PTEN基因发挥抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖的作用，从而抑制癌症的发生和发展.有关应用红景天苷干预卵巢癌的文献甚少，本研究为红景天苷抑制卵巢癌SKOV3细胞增殖提供一定的理论依据.