基于网络药理学探讨罗汉果有效成分抗肺癌的作用机制

王蕾 李梓宇 钟英英 安欢 叶云

摘  要：为分析罗汉果治疗肺癌的潜在作用机制，通过TCMSP数据库及网络药理学分析得出罗汉果中有182个潜在有效成分，运用化合物-靶点及蛋白相互作用网络筛选出4个与抗肺癌相关的有效成分及5个抗肺癌关键靶点。这5个关键靶点主要富集在cAMP、HIF-1和TNF等信號通路，且5个关键靶点在肺癌组织中的转录水平和蛋白水平有差异表达，与患者的预后相关。对上述有效成分及关键靶点进行分子对接，结果表明，关键靶点SRC基因与山柰酚对接效果最高，为-9.9 kJ/mol。本研究初步揭示了罗汉果中多成分、多靶点、多通路治疗肺癌的作用机制，为进一步探究肺癌的治疗策略提供借鉴。

关键词：罗汉果;肺癌;网络药理学;山柰酚;酒渣碱;信号通路

中图分类号：R285.5        DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2022.02.016

0    引言

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤，起源于支气管黏膜或腺体，且具有恶性程度高、预后差等特点[1]。全球肿瘤统计结果显示，肺癌的发病率和死亡率均远高于其他恶性肿瘤，位居首位，在我国早已取代肝癌成为恶性肿瘤首位死因，其5年生存率仅为20%[2-3]。当前肺癌主要采取以手术治疗为主的综合治疗，由于肺癌早期无明显症状，80%的患者确诊时已是晚期[4]，基本无法通过手术治愈。采用化疗手段对患者进行治疗时，因其对肿瘤细胞无选择性，导致在杀灭肿瘤细胞时，也杀伤了正常细胞，严重降低了患者的生活质量。此外，肿瘤的耐药性等原因也使得治疗难度加大，因此，寻找一种能有效治疗肺癌且副作用小的治疗方式具有重要 意义[5]。

罗汉果是葫芦科罗汉果属植物的成熟果实，是一类药食同源、主产广西的中药，其味甘、性凉。现代药理研究显示，罗汉果具有清热润肺、利咽开音、润肠通便等功效[6]，且具有保护肝脏、降糖降血脂、抗氧化、抑菌消炎和抗癌等药理作用[7-8]。目前绝大多数治疗肺癌的药物属于毒副作用大的化学合成药物，因此，低毒的天然化合物对研发抗癌新药有着广阔的应用前景[9]。有实验表明罗汉果苷水溶液的各项毒理学观察参数均未超过安全标准，Ames致突变试验结果显示阴性，表明罗汉果提取物的低毒性适合用来研发新药[10]。罗汉果醇对多种癌症具有很好的防癌和抗癌作用，并且罗汉果醇的浓度越高，抑制癌细胞增殖的能力越强[11]，这充分说明了罗汉果具有治疗肺癌的功效。由于中药本身具有复杂性，现有研究对罗汉果如何抗肺癌的作用机制仍不明确，无法系统、科学地阐述其作用机制，使得罗汉果在临床应用上受到制约，因此，探讨罗汉果对肺癌的作用机制极有意义。

基于网络大数据的网络药理学方法适合用来研究具有多成分、多靶点、多通路的中药作用机理。本研究利用网络药理学方法，挖掘罗汉果治疗肺癌的有效成分、筛选肺癌相关作用靶点，分析这些有效成分和靶点蛋白的作用，并构建相应的网络药理图，筛选得到关键靶点。最后在数据库中对关键靶点进行验证，为在临床上应用罗汉果治疗或辅助治疗肺癌提供理论支撑。

1    材料与方法

1.1   材料

TCMSP（traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform）数据库（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、SwissTargetPrediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）、GeneCards数据库（https.//www.genecards.org/）、STRING数据库（https：//string-db.org/）、Metascape数据库（metascape.org/）、Kaplan-Meier Plotter数据库（https：//kmplot.com/analysis/）、GEPIA数据库（http：//gepia.cancer-pku.cn/）、HPA数据库（the human protein atlas，https：//www.proteinatlas.org/）、PDB数据库（http：//www.rcsb.org/）、Venny 2.1在线作图网站、 Cytoscape 3.6.1软件、PyMOL软件、Auto Dock软件等。

1.2   方法

1.2.1    罗汉果有效成分和成分靶点的搜集

通过TCMSP平台检索罗汉果的全部有效成分，通过成分药物动力学参数进行筛选。相关筛选条件为：口服利用度（oral bioavailability， OB）≥30%，药物相似性（drug-likeness，DL）≥ 0.18。将罗汉果中的目标化合物结构导入SwissTargetPrediction数据库中，对罗汉果的有效成分进行作用靶点预测，得到罗汉果有效成分的作用靶点集合。

1.2.2   罗汉果有效成分靶点与肺癌靶点的搜集

通过GeneCards数据库，以“Lung Cancer”作为关键词检索肺癌相关靶点。将搜集到的肺癌靶点与罗汉果有效成分靶点导入Venny 2.1在线作图网站，得到罗汉果有效成分抗肺癌的交集靶点。

1.2.3   构建“化合物-靶点”及关键靶点的蛋白-蛋白相互作用网络（PPI）

将罗汉果有效成分与其抗肺癌交集靶点导入Cytoscape 3.6.1软件中，构建“化合物-靶点”网络，通过STRING数据库对罗汉果抗肺癌的交集靶点进行分析，蛋白种类为“Homo- sapiens”，构建罗汉果治疗肺癌的蛋白相互作用网络，使用Cytoscape 3.6.1 软件对蛋白相互作用图进行可视化。

1.2.4   关键基因靶点的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

利用Metascape数据库对关键靶点进行GO（gene ontology）功能富集分析和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）生物學通路富集分析，P < 0.05作为显著差异筛选条件，将分析得到的结果利用微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn/）在线绘图。

1.2.5    构建关键基因靶点在肺组织中的蛋白表达图

使用HPA数据库获得关键靶点基因在正常组织与肺癌组织中的蛋白表达图。

1.2.6    构建生存曲线

通过Kaplan-Meier Plotter数据库进行生存分析，得到关键靶点基因在肺癌中的生存曲线图，获得基因表达与疾病预后的信息。P < 0.05代表有统计学意义。

1.2.7    分子对接验证

在TCSMP数据库中获得罗汉果有效成分的结构;在PDB数据库中获取关键靶点基因的3D结构;然后通过PyMOL软件脱水去除活性中心的配体，使用Auto Dock软件进行分子对接，以结合能作为评价对接结果的标准。

2    结果

2.1   罗汉果有效成分及其靶点的收集

检索TCMSP数据库，其中收录了罗汉果182个有效成分。进一步以OB≥30%和DL≥0.18作为筛选条件，获得有效成分11个，如表1所示。根据是否与肺癌相关，筛选得到9个有效成分（MOL-010105、MOL010131、MOL001494、MOL001-506、MOL001749、MOL002140、MOL000358、MOL000422、MOL009295），再通过SwissTargetPrediction数据库对9个有效成分进行靶点垂钓，检索到罗汉果有效成分的作用靶点428个，删除无效和重复的靶点后，获得罗汉果有效成分靶点312个。

2.2   获取有效成分靶点与疾病靶点的共同靶点

检索GeneCards人类基因数据库，收集到肺癌疾病靶点22 399个。通过在线Venny 2.1，将312个有效成分潜在靶点与22 399个肺癌靶点取交集，得到295个共同靶点，如图1所示。将这295个共同靶点作为罗汉果有效成分抗肺癌的预测靶点来进行下一步的分析。

2.3   “化合物-靶点”网络和PPI网络的构建与分析

将罗汉果中的9个有效成分与295个共同靶点导入Cytoscape软件，构建“化合物-靶点”网络图进行网络拓扑学分析，如图2（a）所示。橙色圆形代表靶点;紫色菱形代表化合物。该“化合物-靶点”互作网络中明显度值较大的依次排列为：kaempferol（山柰酚）、flazin（酒渣碱）、beta-sitosterol（β-谷甾醇）和mandenol（甘露醇），说明这4种化合物极有可能是罗汉果治疗肺癌的关键化合物。

将得到的295个共同靶点导入STRING数据库，构建各靶点之间的PPI网络图，如图2（b）所示。在PPI网络中，共有295个节点和1 002条边，连线紧密表明靶点之间联系较为密切。在PPI网络中度值（Degree值）较高，处于核心位置的靶点有AKT1、SRC、EGFR、ESR1、MMP9。

2.4   GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

为了进一步研究罗汉果抗肺癌的生物学功能，通过Metascape数据库对上述295个共同靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。以    P < 0.05作为筛选条件，共得到201个生物过程（biological process，BP），52个分子功能（molecular function，MF），47个细胞组分（cellular component，CC）和87条KEGG通路。富集程度排名前20位的分析结果如图3（a）—图3（c）所示。主要富集的生物过程包括：细胞对有机环状化合物、氮化合物的反应，对脂质代谢过程、系统过程、类固醇代谢过程的调节，以及调控激素水平和MAPK级联反应等。分子功能则主要富集在分子功能的激素结合与一元羧酸结合、蛋白激酶活性、核受体活性、碳酸盐脱水酶活性、氧化还原酶活性等。另外，靶点主要与膜筏、神经元细胞体、囊泡腔、突触后膜、内溶酶体腔等细胞组分有密切关系。

关键靶点的KEGG通路富集分析排名前20位的分析结果如图3（d）所示，靶点主要参与氮代谢、细胞凋亡、cAMP通路、缺氧诱导因子（HIF-1）信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、PPAR信号通路以及AMPK信号通路等。

2.5   关键靶点的基因表达差异分析

在转录水平上，通过检索GEPIA数据库发现，与正常肺组织相比，MMP9在肺腺癌组织中的表达存在显著差异，如图4所示。说明其可能在肺癌的发生过程中发挥比较重要的作用。

图4   （网络版彩图）肺腺癌和正常肺组织中AKT1、 EGFR、ESR1、MMP9和SRC的表达差异图

2.6   关键靶点在肺组织中的蛋白表达

为进一步了解关键靶点SRC、AKT1、ESR1、MMP9和EGFR在肺癌中的差异表达，在蛋白表达水平对其进行验证。通过检索HPA数据库发现，这些关键靶点基因编码的蛋白在正常肺组织与肺癌患者肺组织中的表达量均存在显著性差异，如图5所示。其中，在肺癌肿瘤组织中，SRC低表达，AKT1、ESR1、MMP9和EGFR则高表达。这些结果进一步提示这些靶点在蛋白水平上的表达异常可能与肺癌的发生发展有一定的关系。

2.7   生存曲线图

由图6可以看出，除AKT1外（P=0.071），其他4个基因的表达与总体生存率均具有统计学意义（P [<] 0.05）。其中SRC、MMP9低表达的患者总体生存率优于高表达组，而ESR1和EGFR高表达的患者总体生存率则优于低表达组。另外，SRC、MMP9的风险比HR > 2，表明这2个基因为肺腺癌的危险因素。

2.8   分子对接

将关键核心靶点与有效成分进行分子对接，得到的结果如表2所示。若结合能小于-20.93 kJ/mol，则表明其有较稳定的结合活性。山柰酚、酒渣碱、β-谷甾醇与关键靶点SRC、AKT1、ESR1、EGFR分子对接结果都低于-20.93 kJ/mol，其中SRC与山柰酚、酒渣碱及β-谷甾醇结合最稳定，分别为       -9.60 kJ/mol、-8.17 kJ/mol和-9.00 kJ/mol，表明罗汉果中核心活性成分与抗肺癌核心靶点的分子对接效果良好。

3    讨论

3.1   罗汉果有效成分分析

根据“化合物-靶点”网络得到罗汉果4个有效成分，分别为酒渣碱、山柰酚、β-谷甾醇和甘露醇。酒渣碱属于β-咔啉类化合物，可以促进抑癌基因PTEN表达，抑制ERK基因表达，抑制ERK信号通路的激活，从而促进癌细胞凋亡。β-咔啉类生物碱可以特异性抑制细胞分裂周期CDK基因，从而抑制癌细胞增殖[12-13]。近年来相关研究表明，山柰酚具有多种抗癌活性[14-15]，通过上调p53和bax的表达、下调bcl-2的表达水平使细胞发生凋亡[16]。此外，山柰酚能从mRNA和蛋白水平抑制ER-Ra的表达，使非小细胞肺癌A549细胞的侵袭和迁移能力降低[17-18]。β-谷甾醇具有抗炎作用，通过阻止炎症因子TNF-α和IL-6的释放以及下调NF-κB信号转导通路，有效减轻由LPS所致的肺水肿和炎症反应[19-20]。甘露醇多作为一种辅助药物治疗肿瘤，作脱水剂使癌细胞脱水，减缓癌细胞代谢及生长。可通过暂时性开放血脑屏障，提高颅内药物浓度，预防非小细胞癌脑转移[21]。

3.2   罗汉果核心基因分析

蛋白互作网络筛选出的SRC、EGFR、ESR1、MMP9、AKT1可能是罗汉果治疗肺癌的关键靶点。SRC在NSCLC细胞中过表达后，通过诱导NSCLC增殖和转移以及激活Fn14/NF-κB信号转导，可阻断槲皮素的抗NSCLC作用[22]。EGFR可以过表达，激活下游重要的信号通路，加速细胞增殖和抑制细胞凋亡。EGFR-TKIs（EGFR酪氨酸激酶抑制剂）可显著改善具有EGFR激活突变的NSCLC患者的总体生存期和无进展生存期，且EGFR-TKIs可阻断EGFR分子活化，抑制EGFR同源或与ERBB3异源二聚体的形成，从而抑制EGFR，阻止下游的信号转导，起到抑制细胞增殖、加速细胞程序性死亡的作用[23]。ESR1（雌激素受体1）和I期非小细胞肺癌患者肺组织中HOXC9基因甲基化的频率高于非癌性病变患者，说明ESR1和NSCLC有密切联系，而SNAI2/SLUG与ESR1 mRNA表达呈显著负相关（P < 0.000 1），说明雌激素受体途径对这些恶性特征有重大影响[24]。MMP9属于基质金属蛋白酶家族，研究表明，MMP9在人非小细胞肺癌组织中的表达显著高于病灶旁边的正常肺组织和良性病变肺组织。并且据统计学分析，MMP9的蛋白阳性率及mRNA表达水平与非小细胞肺癌的临床分期、分化程度、淋巴结转移及远处转移密切相关，由此可以说明MMP9在非小细胞肺癌的发生和发展进程中起着较为重要的作用[25]。AKT1异常活化会促进癌细胞生长，抑制细胞凋亡，通过抑制或阻断AKT通路，可以起到抑制肺癌的作用[26]。

3.3   罗汉果富集结果分析

GO功能富集分析显示类固醇代谢、激素水平调节、激素结合、蛋白激酶活性这些生物学过程与癌症的代谢与发展有着密切的联系。KEGG通路分析发现罗汉果主要通过癌症通路、神经活性配体受体相互作用信號通路、cAMP信号通路和HIF-1信号通路、TNF信号通路等通路参与调控，cAMP信号通路在细胞中对许多胞外刺激（如激素、生长因子等）所引起的反应起着重要作用，参与调控细胞增殖、凋亡等生理活动[27]。研究表明，HIF-1信号通路调控并参与细胞葡萄糖代谢、细胞增殖及血管形成的蛋白质表达，在缺氧的环境下诱导产生HIF-1α，激活下游靶基因VEGF，从而诱发肿瘤细胞生成血管[28]。以上结果表明罗汉果的有效成分通过这些生物学过程及通路参与肺癌的 治疗。

由GEPIA数据库的基因差异表达结果可知，SRC、AKT1、ESR1、MMP9和EGFR这5个靶点基因在正常肺组织和肺癌患者肺组织中有极显著的表达差异。SRC、AKT1和MMP9低表达组的患者总体生存率大于高表达组，而ESR1和EGFR高表达组的患者总体生存率大于低表达组。以上结果说明，SRC、AKT1、ESR1、MMP9和EGFR在正常组织和肺癌组织中的蛋白水平存在差异，且与肺癌的预后密切相关，从而更有力地说明这些关键靶点与肺癌紧密相关，影响着肺癌的发生与发展过程。

4    结论

本研究发现罗汉果中9个与肺癌相关的有效成分，检索这9个有效成分的靶点与肺癌相关靶点，取交集得到295个作用靶点，分析295个作用靶点发现氮代谢信号通路、cAMP信号通路、HIF-1信号通路、TNF信号通路等多条信号通路为主要作用通路。通过“化合物-靶点”与PPI网络图构建，筛选出与抗肺癌高度相关的4个有效成分和5个关键作用靶点。在蛋白水平上验证了5个关键靶点的表达与肺癌发生发展有一定关系，生存分析结果进一步说明5个关键靶点与肺癌患者的预后密切相关。本研究分析了罗汉果通过多成分、多靶点、多通路治疗肺癌的作用机制，为深入研究罗汉果治疗肺癌的作用机制提供了一定的参考，为临床上应用中药治疗肺癌和中药现代化提供了新思路。

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The mechanism of the effective ingredients of Siraitia

grosvenorii in the treatment of lung cancer based on

network pharmacology

WANG Lei， LI Ziyu， ZHONG Yingying， AN Huan， YE Yun*

（School of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University of Science and Technology，

Liuzhou 545006， China）

Abstract： The mechanism of the potential effects of Siraitia grosvenorii in the treatment of lung cancer was analyzed. 182 potential active ingredients were found in Siraitia grosvenorii through TCMSP      database and network pharmacological analysis. Four active ingredients and five key anti-lung cancer targets were screened by component-target and protein-protein interaction network. These 5 key targets were mainly enriched in cAMP， HIF-1 and TNF signaling pathways， and the transcription level and  protein level of them were differentially expressed in lung cancer tissues， which was related to the  prognosis of patients. The results of molecular docking with the above active ingredients and key       targets show that the docking effect of key target SRC gene with kaempferol was -9.9 kJ/mol， the   highest. This study reveals the mechanism of multi-ingredient， multi-target and multi-pathway of       Siraitia grosvenorii in the treatment of lung cancer， providing reference for further exploration of the strategies of lung cancer treatment.

Key words： Siraitia grosvenorii; lung cancer; network pharmacology; kaempferol; flazin; signaling     pathway

（責任编辑：于艳霞）