分析测试HPLC法测定糯米藤中槲皮素和山柰酚的含量*

盘 涌，罗彩神，覃日宏，柳贤福，梁 芳

(广西中医药大学赛恩斯新医药学院，广西 南宁 530001)

糯米藤Gonostegiahirta，又名捆仙绳、糯米菜、糯米草等，为荨麻科糯米团属植物[1]，糯米藤，性平，味甘，无毒；具清热解毒、健脾、消肿散瘀功效。主要用于治疗肿毒、痢疾、消化不良、痛经等；外敷可以治疗跌打损伤；对于咳血、吐血、外伤出血也有很好的止血消炎作用[2]。糯米藤作为我国苗族传统用药，多为南方地区用药，在贵州民间治疗各类疾病，尤其是对骨折和消化系统疾病患者有较好的效果。糯米藤中化学成分有一定的研究，化学成分虽较明确，但基础研究薄弱，空白点较多[3-6]。目前该药材尚未被收入《药典》标准，缺少有效的质量控制方法，制约着该植物的开发利用，目前尚未有文献报道其有效成分质量控制方法。本项目以糯米藤为研究对象，采用采用HPLC法测定糯米藤中槲皮素和山柰酚含量，为糯米藤的质量控制提供科学依据。

1 实 验

1.1 仪 器

Agilent1200高效液相色谱仪，美国Agilent公司；B3500S-MT超声清洗仪，上海必能信超声有限公司；Millipore Simplicity-185超纯水仪，美国密里博公司；电热恒温鼓风干燥箱，上海跃进医疗器械厂；BP211D电子分析天平，德国赛多利斯； SHZ-D循环水式真空泵，巩义市予华仪器有限公司。

1.2 试 药

对照品槲皮素(批号：3467，HPLC纯度≥99.30%)、山柰酚(批号：6990，HPLC纯度≥99.90%)，均购于上海诗丹德标准技术服务有限公司；糯米藤于2021年8月分别采至广西南宁市、广西柳州市和广西百色市，经广西中医药大学赛恩斯新医药学院中药鉴定教研室苑敏副教授鉴定为荨麻科糯米团属植物糯米藤的全草。甲醇(色谱纯)，美国Fisher科学世界公司；其余试剂均为分析纯；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为X-Peonyx C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为甲醇-0.1%磷酸(55:45)；检测波长为360 nm；流速为1.0 mL·min-1。柱温30 ℃；进样量为10 μL。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取105 ℃干燥至恒重的槲皮素和山柰酚对照品适量，加甲醇制成每1 mL分别含0.16 mg、0.022 mg的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取糯米藤粉末1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，密塞，称定重量，超声提取40 min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过0.45 μm微孔滤膜，取续滤液，即得[7]。

2.4 专属性试验

分别精密吸取上述混合对照品溶液和糯米藤供试品溶液各10 μL进样分析，结果见图1。槲皮素和山奈酚的保留时间分别为8.9和13.5 min，与各自相邻峰的分离度>1.5。

图1 混合对照品(A)和样品(B)的色谱图

2.5 线性关系考察

精密量取“2.2”项下对照品溶液1，2，4，8，10 mL分别稀释到10 mL容量瓶中，精密吸取10 μL注入高效液相色谱仪进行分析，以进样量X(μg)为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制标准曲线，得到槲皮素回归方程为Y=3946.2X+64.451， (r=0.9999)，山柰酚回归方程为Y=7901.7X-33.716，(r=0.9999)。结果表明，槲皮素和山柰酚分别在0.16～1.6 μg，0.022～0.22 μg范围内呈良好的线性关系(图2)。

图2 线性关系考察结果

2.6 精密度试验

精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液10 μL，连续进样 6次，计算槲皮素和山柰酚的峰面积RSD分别为0.96%和0.89%。表明仪器精密度良好(表1)。

表1 精密度试验结果

2.7 重复性试验

取广西南宁糯米藤样品，按“2.3”项下方法分别制备 6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，按回归方程计算槲皮素和山柰酚含量。结果平均含量分别为0.3841 mg·g-1和0.09793 mg·g-1，RSD分别为1.01%和1.79%。表明方法重复性良好(表2)。

表2 重复性试验结果

2.8 稳定性试验

取同一份供试品(批号1102091)，按“2.1”项下色谱条件分别在0，2，6，10，16，24 h进样10 μL，测定槲皮素和山柰酚的峰面积，RSD分别为1.18%和1.66%(n=6)。表明供试品溶液在24 h内稳定(表3)。

表3 稳定性试验结果

2.9 加样回收率试验

精密称取已知含量广西南宁糯米藤样品6份，分别精密加入一定量的槲皮素和山柰酚对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样10 μL，测定槲皮素和山柰酚的含量。平均回收率分别为98.77%和99.29%，RSD分别为0.92%和1.91%，表明该方法可靠，准确度高。结果见表4。

表4 加样回收率的实验结果(n=6)

2.10 样品的测定

精密称取3批糯米藤1 g，每批3份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定其中槲皮素和山柰酚的含量，结果见表5。

表5 含量测定结果(n=3)

3 结 论

本文采用DAD检测器，经全波长扫描得到糯米藤的3D图谱，结果显示在波长为360 nm处，槲皮素和山柰酚吸收最好，灵敏度最高，故选择360 nm作为测定波长，考察了回流提取、索氏提取、超声提取、冷浸4种提取方法，结果显示超声提取较好，且操作简便。考察了甲醇和乙醇两种提取溶剂，结果表明以甲醇作为提取溶剂提取率较高，分离度好，对称因子接近1，且干扰少，故选用甲醇作为提取溶剂。

本文考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液4种流动相系统，结果显示以甲醇-0.2%磷酸溶液(55:45)为流动相，分离度较好(R>1.5)，保留时间适中，峰形亦较好。

样品测定结果表明，采收至广西不同地区的3批糯米藤样品所含的槲皮素和山柰酚的含量差别不大，质量相对比较稳定。本文建立的槲皮素和山柰酚含量测定方法，可以较好地反映糯米藤中槲皮素和山柰酚的含量，结果准确，重复性良好，对糯米藤的质量控制有一定意义。