漫谈硼亲和材料的进展与应用*

潘志恒，涂雪莹

(佛山职业技术学院，广东 佛山 528137)

近年来，硼亲和材料可特异性吸附复杂基质样品中的顺式二羟基化合物，广泛应用于糖蛋白、核苷酸、RNA等生物样品的分离富集，这些生物分子对人类生命活动及临床医学具有非常重要的研究意义，因此本文对其研究进展进行总结和综述，以便为科研工作者提供参考。

1 硼亲和材料的作用原理

硼亲和是基于酸碱条件下，硼酸和顺式二羟基化合物发生可逆共价反应，作用原理如图1所示，碱性条件下，硼原子与顺式二羟基化合物发生共价结合，而在酸性溶液中，发生解离。

图1 硼亲和材料作用原理图[1]

2 硼亲和材料的发展

硼酸与顺式二羟基化合物的结合反应早在1838年被发现，之后硼酸与各种糖醇和顺式二醇的相互作用被更多的研究；1949年，Boeseken首次用硼酸测定碳水化合物的构型，发现在酸性环境下，很容易形成硼酸络合物，纸层析分离显色剂中加入硼酸，成功分离糖[2]；1959年，Lorand和Edwords研究了苯硼酸盐水溶液离子与几种多元醇的络合平衡，证明了苯硼酸在碱性溶液中以sp3杂化的四面体存在[3]；1963年，Bourne等[4]证明了无环多羟基化合物在含有苯硼酸的溶剂中的RF值比它们衍生的醛糖或酮糖高得多，并提供了快速分离这类化合物对的方法。weith等[5]在1970年研究了含二羟基硼基纤维素衍生物的合成及其与糖和核酸形成络合物的能力，并制成分离纯化色谱柱，用于糖类和核酸的分离，此后硼亲和材料得到迅速发展。2006年Hilder等[6]结合整体柱和硼亲和材料的特点，研制了适合于微型硼酸盐亲和色谱的新型大孔整体固定相材料，大大扩大了硼亲和的应用范围。此后十多年时间里面，一系列具有独特功能的硼亲和材料被开发出来，包括硼亲和纳米材料、大孔整体柱、介孔材料、温敏材料、硼亲和分子印迹聚合物等，这些材料在代谢组学、糖组学和蛋白质组学等领域得到广泛应用，极大拓宽了分离纯化的对象，包括小分子化合物(类固醇、酮类、苷类、沙丁醇胺等)，大分子化合物(糖蛋白、多肽等)，基于硼亲和相互作用的仿生分离介质在纯化抗体和疾病特异性抗原等领域显示了先天优势。

3 硼亲和材料的种类

3.1 大孔整体柱

大孔整体柱是由单体、交联剂、引发剂和致孔剂的混合物在空柱管内原位聚合得到的连续多孔高聚物固体材料，材料表面可根据需要作相应的功能化衍生化，通过调整聚合单体的结构、比例、聚合温度、时间等条件，可以制备具有不同孔径及分布的功能性整体柱，以适应不同需求和分离模式，整体柱通常具有制备简单、通透性好、柱压低的特点[7]。研究者们结合整体柱和硼亲和技术的优点，制备了各类硼亲和整体柱，包括有机聚合物整体柱、有机无机杂化整体柱、分子印迹整体柱。

3.1.1 无机硅胶整体柱

无机整体柱相对于有机基质来说，硅胶无机硅胶整体柱在机械强度、耐高压、化学稳定性等方面具有优势，其表面丰富的硅羟基非常有利于化学基团进行表面修饰改性，可用于制作各种固定相，广泛用于小分子的分离、纯化和分析。但是，其pH值适用范围比较窄，在碱性溶液中稳定性差。近年来有学者用金属材料制作硼亲和材料，金属硼酸盐具有独特的结构类型，使其在传统的微孔材料的催化、吸附、分离、荧光材料等领域都具有潜在的应用价值。

3.1.2 硼亲和有机聚合物整体柱

制备有机聚合物整体柱的方法相对简单，通常是将单体混合物及致孔剂注入到空管柱中，除气泡，经热、紫外光或者γ-射线引发使单体混合物聚合，得到连续多孔机物聚合物材料，这种材料的形状是集成的，孔结构与其他色谱柱不同，可以使液体直接流过较大的介孔。其单体来源广泛，制备简单，可耐受更高的pH范围和更高的温度，具有良好的生物相容性。2006年，Hilder等[6]制备了第一批硼亲和有机聚合物整体式柱，并利用液相色谱和毛细管电色谱有效分离了核苷类化合物。2009年，Liu等[8]研制了“一步法”制备硼亲和有机聚合物整体柱，解决了后修饰方法的费时费力的缺陷。

3.1.3 有机无机杂化整体柱

有机聚合物整体柱虽然适用的pH值范围比较广(pH 1～14)，且容易制备，但是由于骨架是纯有机化合物，刚性不足，耐热稳定性低，不耐有机溶剂的溶胀作用，由此在一定程度上限制了其应用，而无机硅胶整体柱和有机聚合物整体柱相比，正好互补了其缺点，因此，为了克服有机聚合物整体柱的不足，新型的有机无机杂化整体柱由此而生。刘震等制备了一种独特的硼亲和杂化整体柱，其可在中性或者弱酸性条件下分离生物分子，如分离人尿中的腺苷[9]。

3.2 硼亲和介孔材料

根据国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)的定义，多孔材料可以分为三种：微孔材料(孔径<2 nm)、介孔材料(2 nm<孔径<50 nm)和大孔材料(孔径>50 nm)。介孔材料具有超高比表面积、大的孔容、可调控的孔尺寸和形貌特性，同时介孔材料的孔壁和孔道结构呈现出纳米尺寸效应，被广泛应用于样品的分离和前处理，其中介孔硅材料较易于被硼亲和修饰。硼亲和介孔硅材料目前主要用于两个方面，一是分离富集，二是药物释放。Xu等[10]在 2009 年首次制备了硼亲和介孔材料，先用 γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(GLYMO) 与 3-氨基苯硼酸反应，得到的产物再与介孔硅反应，该硼亲和材料能够用于糖肽的选择性富集，这是第一次将介孔材料引入糖蛋白组学中来，与直接(传统)分析相比，这种新方法使糖肽的检测限提高了2个数量级。有机硼酸基团的无偏性质也使得该方法适用于所有类型的糖肽。

3.3 硼亲和纳米材料

纳米材料是指在三维空间中至少有一维处于纳米尺寸(0.1～100 nm)或由它们作为基本单元构成的材料。目前，越来越多的纳米材料作为吸附剂提高有效成分的提取率。磁性纳米材料具有易分离、表面改性、吸附能力强、生物相容性好等特点，在样品预处理、分离纯化等方面得到了广泛的应用。硼亲和磁性纳米材料对于分离纯化顺式二羟基化合物具有明显优势，但是其与糖蛋白的结合力普遍较弱，因此很难分离富集低含量的糖蛋白。刘震等利用多位点协同作用，合成了具有协同作用的树枝状硼亲和磁性纳米材料(dBA-MNPs)，其与糖蛋白的亲和力比普通的材料相比，提高了1000～10000倍，可以用于分离浓度低至2×10-14mol/Ld 糖蛋白[11]。

3.4 硼亲和分子印迹聚合物

分子印迹技术又叫做分子印记技术、分子烙印技术或分子模板技术，是一种新兴的分子识别技术，其目的是制备对模板分子具有特异选择性识别能力的聚合物，即分子印迹聚合物(MIPs)。由于该技术具有预定性、可识别性和实用性等特点，在很多领域(如色谱分离、固相萃取、仿生传感、模拟酶催化、临床药物分析等)中得到了广泛的应用。刘震等提出了制备糖蛋白的分子印迹聚合物的通用方法，并发展制备了糖蛋白的分子印迹聚合物图案化阵列的软光刻方法。该方法由于采用了快速的光聚合法避免了蛋白质构象的变化[12]。在此基础上，其又提出了基于硼亲和作用的可控定向表面印迹法，不仅可以制备二维阵列，还可以制备分子印迹整体柱[13]。

3.5 硼亲和温敏材料

Roohi等[14]采用偶氮引发剂改性的介孔二氧化硅微球，通过可逆加成-断裂链转移(RAFT)介导的聚合反应，接枝温度敏感聚合物(聚-N-异丙基丙烯酰胺，PNIPAAM)。该材料对五种疏水类固醇的分离是有效的，当柱温高于PNIPAAM的最低临界溶液温度时，保留时间和分离效率都随着柱温的升高而提高。Li等[15]的研究表明 2，4-二氟-3-甲酰基苯硼酸(DFFPBA)具有超高的硼酸与单糖的结合亲和力，而且具有适当间隔臂的单体对小分子量的顺式二醇具有较低的结合pH值(6.0)，这些优点使得DFFPBA功能化整体柱适合于在中性和弱酸性真实样品中富集痕量顺式二醇类化合物。Lu等[16]报道了一种pH值调控策略，用于微调硼亲和整体柱对两类糖蛋白的特异性，即唾液酸化和非唾液酸化糖蛋白。

4 硼亲和纳米材料的应用

4.1 对糖蛋白的分离富集应用

很早之前，人们就已经利用硼亲和色谱材料对顺式二羟基化合物进行分离纯化，主要是糖类及一些糖蛋白。硼亲和配体在碱性条件下可以与顺式二羟基分子结合，形成稳定的五元环或者六元环，而在酸性环境下，可逆的解离释放出顺式二羟基分子。因此，在糖类、糖蛋白及儿茶酚物质的分析检测方面，相对与凝集素亲和色谱、亲水作用色谱等其他方法，具有简单便捷高效的优势。随着糖蛋白组学的发展，糖蛋白的分离检测越来越具有重要意义。糖蛋白在生物体内发挥至关重要的胜利作用，许多疾病的发生与蛋白质糖基化有关，如在肿瘤发生的过程中，会产生不同水平蛋白质糖基化。但是体内糖蛋白的含量水平是非常低的，而且存在于成分复杂的生理体液当中，浓度高的蛋白对于糖蛋白的检测产生了严重的干扰和信号掩盖等问题，因此必须采取必要的手段对糖蛋白进行富集，其中硼亲和材料的应用是最广泛的，而且在不断发展。Song等首次在金电极的表面修饰了硼酸基团，并用于血浆样品中糖基化血红蛋白的检测[17]。电化学检测手段属于在线检测，工序简便省时，周期短，也为糖蛋白的检测提供了发展的空间。

4.2 对糖的分离富集应用

血糖监测对于临床诊断、控制和治疗糖尿病是至关重要的，基于硼亲和的电化学葡萄糖传感器对糖尿病患者在临床上的血糖水平检测具有很好的应用前景，如柏占明构建了基于硼亲和作用的夹心型葡萄糖电化学传感器，能够在 0.5～20.0 mM的范围较好的检测糖原水平[18]。

4.3 对核苷的分离富集应用

核苷是核酸的主要组分，一些核苷及其衍生物具有重要的生理功能，例如，肌苷可以治疗急慢性肝炎和风湿性心脏病。许欢欢采用表面引发-可逆加成-断裂链转移聚合(SI-RAFT)技术，制备了一种高吸附容量、吸附动力快、选择性高的的新型硼酸亲和吸附剂用于血清样品中核苷的分离富集，检测出小牛血清中尿苷和鸟苷的含量分别为(170±1.6) ng/mL 和(39.6±4.4) ng/mL[19]。

4.4 对儿茶酚胺的分离富集应用

儿茶酚胺是一种含有儿茶酚和胺基的神经类物质，越来越多的证据表明它们在疾病的发生和发展中发挥着不同的作用。许多学者对儿茶酚胺进行了研究，现阶段最重要的研究目标是如何快速准确地检测目标物质。Ozdemir等将氨基苯硼酸键合在氯甲基化的树脂球上，制备了3-氨基苯基硼酸功能化聚(3-氯-2-羟丙基甲基丙烯酸酯)(APBA功能化聚(HPMA-Cl))微球，用于儿茶酷胺的分离，通过实验结果表明，APBA功能化聚(HPMA-Cl)微球是一种很有前途的儿茶酚胺吸附剂[20]。

4.5 药物分析检测和传递的应用

药物检测由于生物样品中干扰比较多，所以样品的处理就尤为重要，王薇等采用硅胶为基质，通过原子转移自由基聚合(ATRP)的方法合成了一种新型高容量硼酸吸附剂，在目标物质与干扰物质摩尔比为 1:50和1:100时，含有顺式邻二醇的药物均能被有效的萃取出来[21]。

4.6 核酸适配体筛选应用

核酸适配体是一小段经体外筛选得到的寡核苷酸序列或者短的多肽，能与相应的配体进行强特异性的稳定结合，它主要是借由一种被称为SELEX法德人工筛选程序产生的，它已经成为蛋白质组学、代谢组学、药物研发等领域的重要研究工具。适配体靶标范围广，靶标的大小与可溶性均不同，因此应用 SELEX 技术筛选核酸适配体可以采用不同的具体操作方法。Ma Yanyan等作首次提出基于硼亲和分子印迹技术的适配体筛选新方法用于糖蛋白核酸适配体筛选[22]。该方法以甘氨酸印迹磁性纳米粒(MNPs)作为与靶糖蛋白结合的亲和力界面，并将靶糖蛋白结合MNPs作为适体选择的亲和力子，然后将目标糖蛋白结合的MNPs作为亲和底物进行适体选择，该方法快速、高效、特异性强，而且大大降低了阴性筛选的概率。

5 结 语

硼亲和材料作为独特的亲和色谱技术，由于蛋白质组学和代谢组学的需要，在近十多年里迎来了一个快速发展阶段。目前的硼亲和材料突破了常规硼亲和材料只能用于碱性pH环境的限制，适用的pH范围扩大中等酸性环境，覆盖了常见的生理样品pH范围，因此大大扩宽了其在糖蛋白疾病标志物识别等领域的应用，同时，多位点协同作用可以有效解决硼亲和材料亲和力若的缺点，展现了硼亲和材料在仿生分离介质方面的美好前景。随着一些基本问题的解决，硼亲和材料将会在复杂生物样品分离纯化中有更大的发展空间和更广阔的应用。