A型塞内卡病毒研究进展

肖佳旭，郭笑然，赵 款，袁万哲

(河北农业大学动物医学院，河北保定 07100)

A型塞内卡病毒(Senecavirus A)也称塞尼卡谷病毒(Seneca Valley virus，SVV)，属于小RNA病毒科塞内卡病毒属。SVA最初被认为是细胞培养物中的污染物，推测其来源于猪胰蛋白酶或胎牛血清。2002年美国马里兰州盖瑟斯堡的研究人员首次在人胚胎视网膜细胞系(PER.C6)中分离得到SVA，并命名为SVV-001[1]。SVA因具有溶瘤特性，因此发现初期多将其应用治疗不同类型的肿瘤[2]。加拿大和美国分别在2008年和2012年报道了SVA引发猪水疱病的病例，这使得人们开始关注塞内卡病的发生与流行。自2014年以来，SVA在北美国家或地区的猪群中暴发，SVA感染新生仔猪的死亡率上升，严重影响仔猪的存活率。2015年SVA首次在我国广东省报道，现已有15个省市报道有SVA的流行。对我国猪群中流行的SVA毒株进行遗传进化和重组分析发现中国猪群中流行的毒株在遗传进化上呈现出复杂多样性，并且出现了新的基因重组毒株[3]，这些提示我们需要进一步加强对我国SVA的流行监测和防控技术储备。

1 病原学

1.1 基因组结构

SVA为无囊膜的单股正链RNA病毒，病毒粒子呈20面体对称结构，直径约30 nm，基因组全长7.3 kb，包含一个独立的开放阅读框(ORF)，两侧分别由5′端非编码区(5′untranslated region，5′UTR)和3′端非编码区(3′UTR)组成。3′UTR包含有polyA。SVA的ORF被核糖体翻译成多聚蛋白，包括L前导蛋白、P1结构蛋白、P2和P3非结构蛋白。SVA病毒粒子结构及基因组结构模式图如图1所示。多聚蛋白经过初级裂解形成L-P1-2A、2BC和P3共3种前体蛋白。P1被3C蛋白酶进一步水解为VP1、VP0和VP3共3个蛋白，VP0在其后组装的过程中被水解为VP2和VP4，其中VP0、VP1和VP3作为病毒衣壳的表面结构蛋白具有良好的免疫原性。P2裂解为3个非结构蛋白2A、2B、2C，其中2A蛋白只有9个氨基酸，推测SVA 2A蛋白仅执行P1-2A/2BC-P3核糖体跳跃功能；P3裂解为4个非结构蛋白3A、3B、3C和3D[4]，3D蛋白含有其他小RNA病毒保守的氨基酸基序，是RNA依赖的RNA聚合酶的主要组成部分，在病毒复制中起到重要作用。

图1 SVA病毒粒子结构及基因组结构模式图[6]Fig.1 Schematic diagram of the structure and genome structure of SVA virion[6]

1.2 培养特性

SVA能够在猪睾丸细胞(ST)、幼龄仓鼠肾细胞(BHK-21)、猪肾细胞(PK-15、SK)、和人非小细胞肺癌细胞(NCI-H1299)等细胞系上增殖，均能够产生明显的细胞病变，主要表现为细胞拉丝最后脱落，因此常利用上述细胞对SVA进行分离与培养[5-6]。

2 流行病学

2.1 SVA分布

2004年，美国印第安纳州发生猪水疱病，排除了外来动物疫病病原的感染，但其病因未明确。2007年加拿大首次报道了SVA感染相关病例，最初猜测可能与当时广泛流行的猪水疱病有关，但并没有实质性证据。2012年美国报道了猪群中有SVA的流行，但追溯发现早在2010年已有猪群感染，并证实了2007年加拿大报道的SVA阳性病例确实与猪水疱病有关。2014年前，除北美地区外，其他地区无SVA的报道，直到 2014 年末，巴西报道了SVA感染病例，而与美国和加拿大不同的是，巴西的SVA感染不仅局限于成年猪，新生仔猪也有感染[7-9]。随后SVA开始在世界各国广泛流行，包括中国、泰国、哥伦比亚和越南等，世界各地的SVA同源性高达95.8%～99.9%，但与SVV-001株的同源性较低(93.8%～94.6%)，说明SVA流行过程中在不断进化[9]。马雪青等[10]在我国湖北某猪场成功分离出一株SVA，并命名为HBWH/2018，通过对病毒基因组全长序列的遗传进化分析，HBWH/1/2018株与HN01/2017株亲缘关系相似性高达99.4%，而与SVV-001株的同源性仅有91.3%。同时中国动物卫生与流行病学中心对SVA进行回顾性监测，发现我国广东、广西、云南、贵州、湖南、福建、江西、四川、湖北、河南、山东、新疆、上海、辽宁和黑龙江等多个省(自治区、直辖市)均有SVA的检出，表明SVA在我国不同区域已广泛流行[6,9]。

2.2 SVA传播

猪是SVA的自然宿主，主要感染新生仔猪，3日龄以内的仔猪感染后死亡率高达到70%～80%，3日龄～7日龄仔猪感染死亡率为30%左右，随着日龄的增加，死亡率逐渐降低。SVA感染一年四季均可发生，春季和秋季多发，病猪的口鼻分泌物和尿液粪便中均可携带病毒，易感动物与病猪直接接触是主要传播途径。临床研究表明，啮齿动物和昆虫可促进病毒传播，通过RT-qPCR在小鼠的粪便和小肠中检测到了病毒核酸，并分离到SVA，表明SVA在环境和小鼠体内都可以存活。小鼠可作为一种天然的贮存体和潜在的传播媒介[11]。研究表明[12]，在猪感染后60 d的扁桃体中仍能检测到感染性SVA的存在，但临床症状已消失，证明SVA在猪体内能够引起持续感染。还有研究表明持续性感染的母猪所产的仔猪仍可被SVA感染。Houston E等[13]对美国临床表现健康的育肥猪和母猪进行血清学检测，可检测到SVA IgG抗体存在，表明临床表现正常的猪存在被SVA感染的可能性。同时Buckley A C等[14]研究比较了早期分离株与当代分离株对猪的致病性，包括SVV001/2002、CAN/2011、HI/2012、IA/2015、NC/2015、SD/2015，结果表明所有接种病毒的猪均检测到SVA，猪体内含有针对每种病毒的交叉中和抗体，并且检测到接种当代病毒的猪体内的中和抗体滴度要明显高于接种早期分离毒株的猪，说明SVA毒力在逐渐加强，应重视对SVA的防控，警惕SVA大流行的暴发。

通过对美国历史SVA毒株(2010年之前鉴定)和全球当代SVA毒株(2011年之后鉴定)的全基因组序列遗传分析的结果表明，两者之间的遗传差异为6.32%，并且与历史SVA毒株相比，在当代SVA分离株的结构蛋白(VP1，VP2和VP3)中观察到了多个氨基酸突变，表明多年来SVA基因组的进化可能是导致近期该病发病率上升的主要原因[15]。同时，我国出现的重组SVA毒株，引起了世界专业领域的关注，基因重组可能是SVA进化的重要机制。

3 致病机理及免疫机制

目前病毒进入细胞以及受体的表达机制尚不清楚。有研究表明，SVA感染机体后，可在表皮细胞、扁桃体树突状细胞和淋巴结巨噬细胞中复制增殖。SVV-001衣壳能够与炭疽毒素受体1(ANTRX1)，也称为肿瘤内皮标记物8(TEM8)特异性结合，它是SVA附着细胞和脱壳的重要受体。SVA相比其他小RNA病毒与受体的结合方式不同，口蹄疫病毒(FDMV)是利用整联蛋白αVβ1、αVβ3、αVβ6、αVβ8作为受体入侵细胞，其VP1蛋白上的氨基酸残基是单独附着于受体上发挥作用；对于脊髓灰质炎病毒(PV)和柯萨奇病毒(CV)来说，受体与病毒衣壳表面结合，在峡谷深处发生相互作用，导致VP1结构发生变化；而SVA是VP1和VP2共同参与受体结合，VP1的CD-loop和VP2的GH-loop在与受体相互作用中起关键作用[16]。WANG M等[17]为了鉴定SVA的猪细胞受体，在ST细胞中敲除与过表达ANTXR1，表明ANTXR1敲除的细胞丧失SVA感染能力，而过表达ANTXR1则显著增强了细胞感染，这些结果证实了ANTXR1是SVA的受体之一。SVA 3C蛋白酶通过降解干扰素调节因子3(IRF3)和干扰素调节因子7(IRF7)或者作为去泛素化酶来抑制视黄酸诱导基因1(RIG-I)、TANK结合激酶1(TBK1)、肿瘤坏死因子受体相关蛋白3(TRAF3)的表达，进而抑制Ⅰ 型干扰素通路，并且敲除RIG-Ⅰ 可以使SVA复制和表达增加，证实了其在SVA感染过程中可以激活Ⅰ 型IFN信号[18]。

SVA除了抑制宿主固有免疫反应外，还可引起宿主细胞凋亡和自噬以增强自身的复制。例如SVA 2C蛋白仅位于线粒体中，能够通过激活caspase-3诱导细胞凋亡，而3C蛋白通过其酶活性诱导细胞凋亡[19]。并且2C和3C通过caspase信号传导途径诱导RIG-Ⅰ 降解以此调节宿主的免疫反应[20]。同时，SVA通过激活蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)和转录因子6(ATF6)途径诱导细胞自噬[21]，从而促进复制。

SVA感染动物会出现短期的病毒血症，但是随着中和抗体水平的升高，病毒血症逐渐消失。病毒感染的早期，由于VP1蛋白可引起宿主细胞凋亡，VP4蛋白位于病毒衣壳内表面故均不适用于疫苗生产，而VP2 和VP3蛋白能够引起宿主产生较高水平的中和抗体，进而使机体抵抗病毒的感染[22]。研究表明，SVA 感染早期T细胞应答显著增强，有助于机体清除病毒。由此可见，SVA感染可以同时激活机体的B细胞和T细胞应答，产生大量中和抗体，所以免疫系统在保护机体抵抗SVA过程中发挥着重要作用。

4 诊断

SVA感染的诊断可以通过直接或间接的检测方法进行，现用于临床和实验室的诊断方法主要包括病原学诊断和血清学诊断[23]。

目前已建立多种方法应用于SVA病原体的检测，包括多种RT-PCR测定方法[24-26]。现针对SVA 3D聚合酶基因成功开发了RT-qPCR检测方法，已作为商品化试剂盒进行售卖。同时根据VP1蛋白保守区域，基于Taq-Man技术的RT-qPCR检测方法也已建立，该方法特异性强，灵敏度高，可实现定量检测。现阶段通过逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)方法与横向流动试纸法相结合，肉眼观察颜色比对即可判定结果，可在现场进行快速鉴别诊断SVA感染[27]。近年已报道了基于逆转录微滴数字聚合酶链式反应(RT-ddPCR)的SVA检测方法，其检测下限比RT-qPCR低约10倍[28]。

表1 用于SVA检测的多种直接和间接方法[23]Table 1 Multiple direct and indirect detection methods for SVA detection

血清学诊断方法主要是检测血清中的抗原或抗体，其中包括间接ELSA、竞争ELISA和病毒中和试验等方法。血清学方法适于大规模的流行病学研究或监测，同时基于临床观察，多个样本中的PCR检测和抗体检测方法相结合的诊断方法比单一诊断方法更有效。目前针对SVA衣壳蛋白VP1、VP2、VP3的ELSA抗体检测方法均有所报道，其中竞争ELISA应用最为广泛，现阶段也已有商品化检测试剂盒。近期，Bai M等[29]开发出使用病毒样颗粒(VLPs)ELISA检测血清抗体，VLPs作为ELISA系统的包被抗原比整个病毒颗粒更安全，同时比单体蛋白或多肽表现出更好的敏感性，特异性和免疫原性，这为病毒诊断又提供了有力的技术支撑。

5 疫苗研究进展

疫苗接种仍然是控制和预防传染病的最有效方法。SVA流行已有数十年，目前还没有商品化疫苗，所以研发高效疫苗显得尤为重要。

Yang F等[36]对SVA 灭活疫苗进行了相关研究和评价，结果表明 SVA 灭活疫苗免疫动物可产生较高水平的抗体，能够对猪起到很好地保护作用。最近，Li Y等[37]又对2018年在我国广东省分离的GD-ZYY02-2018毒株进行遗传进化分析，结果表明该毒株属于美国样毒株，并与中国最近流行的SVA株具有紧密的遗传关系，同时用灭活的GD-ZYY02-2018株接种的猪可以产生高滴度中和抗体，初步表明该灭活毒株可用作深入研究的候选疫苗株，能够防止和控制SVA传播和流行，但仍需进一步研究来验证SVA灭活疫苗的安全性和保护率等，最重要还是要探究灭活的SVA疫苗是否能保护猪免受异源毒株的攻击。Sharma B等人[38]参考SVV-001 5′UTR区域的碱基，通过反向遗传学技术对SVA SD15-26毒株5′UTR的29、31和32位置处的碱基由C 突变为T ，并且为了和野毒株进行区分，将VP4区域的SacⅡ酶切位点失活(942位置处由C突变为A)，拯救出一株重组的突变病毒(rSVAmSacⅡ)。结果显示该突变病毒是一株弱毒株，动物经接种后未出现明显临床症状，但是该病毒保留了良好的免疫原性，能够刺激机体诱导产生针对 SVA 的中和抗体，对猪起到了保护作用。突变4个碱基毒力减弱，可能是由于在5′UTR或者P1编码区的基因突变引起的关键元件构象的改变，例如内部核糖体进入位点(IRES)或顺式RNA元件(CRE)等。2020年Mu S等[39]利用原核表达系统表达SVA衣壳蛋白并在体外成功组装出病毒样颗粒(VLPs)，免疫动物后VLPs疫苗可同时引起细胞和体液免疫应答，其所诱导中和抗体水平与灭活的SVA疫苗相似。VLPs疫苗与活疫苗和灭活疫苗相比，不含病毒核酸，没有增殖能力，免疫原性好，安全性高，是目前疫苗的发展研发方向。最近，Zhang X等[40]人建立了一种包含CMV和T7启动子的改良双启动子反向遗传系统，可通过真核或原核RNA聚合酶系统拯救SVA，操作简便，可在短时间内拯救出SVA，为研究高效SVA疫苗提供了有力的技术支撑。

6 结语与展望

近年来，SVA在多个国家均有暴发流行的报道，世界各国研究人员在病原学、流行传播、致病机制、诊断及疫苗的研发方面取得了巨大的进展。但由于感染SVA后，其临床症状与其他水疱病的临床症状极其相似，所以快速准确诊断鉴定尤为重要。虽然SVA现阶段还没有像口蹄疫那样带来毁灭性的危害，但不容忽视的是小RNA病毒具有极强的基因变异能力和重组能力，毒力逐渐加强，很难预测其未来的流行发展情况。因此，应深入研究SVA的致病性、免疫机制及遗传进化分析等，持续关注SVA的演变趋势，同时研发高效的疫苗和诊断制剂来做好防控技术储备。