液相色谱-串联质谱法测定婴幼儿奶粉中的脂溶性维生素

郑国建，林毅侃，印杰

（上海市质量监督检验技术研究院，上海 200233）

0 引言

婴幼儿配方奶粉作为非母乳喂养婴儿的主要食物来源，含有其生长发育的所有营养[1]。脂溶性维生素是婴幼儿进行正常新陈代谢所必须的。如维生素A缺乏可导致儿童失明[2]；维生素D缺乏会对骨骼造成影响[3]；维生素E缺乏可导致人体生殖系统、肌肉系统等异常[4]。因此国家对婴幼儿配方奶粉制定了严格的产品标准，如GB 10765-2010[5]，GB 10767-2010[6]。用于测定脂溶性维生素（维生素A、E、D、K1、）的国家标准有2个：GB 5009.82-2016[7]、GB5009.158-2016[8]。相应的AOAC方 法 有3个：AOAC 2012.10[9]、AOAC 2016.05[10]、AOAC 2015.09[11]。在使用上述方法时需对样品进行差异化处理，且处理过程复杂，同时需使用多台套设备进行定性定量分析。本研究将建立一个同时检测该4种脂溶性维生素的液相色谱-串联质谱方法，简化样品处理步骤，提高处理能力，提高检测效率。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

维生素A、维生素A棕榈酸酯、维生素醋酸酯、维生素E、维生素E醋酸酯、维生素D3、维生素K1、二丁基羟基甲苯（BHT）购于Sigma公司；二氯甲烷、甲醇、乙腈、异丙醇、甲酸为色谱纯购于Fisher Scientific；正己烷、环己烷、乙醚、石油醚、甲基叔丁基醚、异辛烷、丙酮为化学纯购于国药化学试剂有限公司；超纯水由Millipore Milli-Q超纯水仪生产。

1.2 仪器与设备

Waters XEVO TQXS液相色谱-串联质谱仪，配有大气压化学电离离子源（APCI），沃特世科技（上海）有限公司；Eppendorf 5804离心机，艾本德中国有限公司；Wiggens Votex 3000涡旋振荡仪，维根技术(北京)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

Waters BEH C182.150 mm，1.7μm。流动相A为0.1%甲酸溶液，流动相B为1%二氯甲烷甲醇溶液，梯度洗脱：0~0.5 min，20%A保持不变；0.5~4 min，20%A线性变化至0%A；4~8.5 min，0%A保持不变；8.51 min变化至20%A，保持2 min；柱温为40℃；流速为0.5 mL/min；进样量为2μL。

1.3.2 质谱条件

大气压化学电离离子源（APCI），正电离模式；电晕电流：15.0μA；锥孔电压：30 V；离子源温度：400℃；干燥气流速为800 L/h；锥孔反吹气流速为150 L/h。离子对、碰撞能量如表1所示。

表1 质谱参数

1.3.3 样品处理

试样前处理条件参考了AOAC 2012.10和AOAC 2015.09，并做了适当修改：精确称取0.500 g试样，加0.1 g BHT，加10 mL水，涡旋混匀，加入20 mL甲醇，涡旋20 s后静置10 min，加入10 mL异辛烷，涡旋20 s，在9 000 r/min转速下离心2 min。取1 mL上清于40℃水浴中氮吹吹干，用丙酮复溶后过0.22μm有机滤膜过滤，进样分析。

2 结果与分析

2.1 液相色谱-串联质谱条件的优化

用于脂溶性维生素测定的仪器方法包括正相色谱法[12]、反相色谱法[13-14]、液相色谱-串联质谱法[15-16]等。维生素A和维生素D有紫外吸收基团，维生素E既有紫外吸收基团又有荧光响应，因此可在液相条件下同时检测。但是维生素K1由于无紫外吸收基团，需使用锌粉还原柱进行还原后再进行检测，导致这4类脂溶性维生素无法同时使用液相色谱分析。因此本研究使用通用性更好的液相色谱-串联质谱仪实现这4类脂溶性维生素的同时检测。

由于采用了直接提取法，所以实验需考虑婴幼儿奶粉中维生素A、E、D、K的所有添加形式。参考了AOAC 2012.10（维生素A、E）[9]、AOAC 2016.05（维生素D）[10]、AOAC 2015.09（维生素K1）[11]可知维生素A主要包含维生素A棕榈酸酯和维生素A醋酸酯；维生素E包括alpha-生育酚和维生素E醋酸酯；以及维生素D3和维生素K1。

由于脂溶性维生素的极性较小，因此当采用直接提取法时，往往使用正相色谱分析，如AOAC 2012.10[9]和AOAC 2015.09[11]中使用了正己烷、甲基叔丁基醚、异辛烷等正相溶剂。而正相体系对液相色谱-串联质谱的硬件要求比较高，需要配置专门的正相脱气包。且正相体系在质谱中应用有一定的危险性。因此本实验探索使用C18反相色谱进行脂溶性维生素的分析。

实验研究了甲醇、乙腈等溶剂对维生素A、维生素A棕榈酸酯、维生素A醋酸酯、维生素E、维生素E醋酸酯、维生素D3、维生素K1在C18色谱柱上的洗脱能力。实验发现当使用乙腈作为流动相时，对维生素A棕榈酸酯的洗脱能力较弱，导致其出峰时间过长；甲醇的洗脱能力强于乙腈，但还是无法满足实验要求的10 min内完成分析的目标。为了加强流动相的洗脱能力，实验在流动相中加入少量的二氯甲烷。当二氯甲烷质量分数达到1%时能显著改善维生素A棕榈酸酯的出峰时间，使其变得尖锐。同时为了保证维生素A、维生素A醋酸酯不要出峰太早，在初始阶段加入适当的水增加流动相的极性，优化后的色谱条件见1.3.1，色谱图如图1所示。图1（a）中，3个峰依次为维生素A、维生素A醋酸酯和维生素A棕榈酸酯。

图1 脂溶性维生素标准品的液相色谱-串联质谱色谱

在电离方法选择上，由于脂溶性维生素极性较小，因此更适合使用大气压化学电离（APCI）对其进行离子化[17]。通过优化APCI的电离参数，优化各脂溶性维生素的选择离子和碰撞能，最终得到各化合物的特征离子对和碰撞能，如表1所示。

2.2 前处理条件的优化

婴幼儿奶粉中脂溶性维生素的提取方法分为直接提取法[8-9,11]和碱溶液皂化提取法[7,10]。由于维生素K1在碱性条件下极不稳定[18]，因此为了实现对脂溶性维生素的同时提取，本研究选用直接提取法。

维生素A、维生素A棕榈酸酯、维生素A醋酸酯、维生素E、维生素E醋酸酯、维生素D3、维生素K1属于脂溶性维生素，易溶于乙醚、石油醚、正己烷、环己烷等有机溶剂。实验选用一实验室阳性奶粉样品进行实验，实验方案为：先用45 g水溶解5 g奶粉样品，涡旋混匀后，取5 g试样，加5 mL水，用20 mL甲醇沉淀蛋白，再使用10 mL适当的有机溶剂提取其中的脂溶性维生素，离心取上层溶剂氮吹吹干后，使用适当的溶剂进行溶剂转换后进样分析。实验中考察了乙醚∶石油醚（1∶1，体积比）、正己烷∶环己烷∶乙醚（4∶4∶2，体积比）、正己烷、异辛烷等提取溶剂的提取效果。

当使用乙醚∶石油醚（1∶1，体积比）和正己烷∶环己烷：乙醚（4∶4∶2，体积比）体系时，离心后水相和有机相之间存在较厚的乳化层，导致测试结果偏低，见表2。当使用正己烷、异辛烷时，离心后水相和有机相能得到较好的分离，但正己烷的提取效率不及异辛烷，如表2所示。最终选择异辛烷作为提取溶剂。

表2 提取溶剂的提取效果

由于异辛烷溶液不能直接进入反相色谱体系，因此需对其进行溶剂转换。在选择复溶溶剂时对比了异丙醇、甲醇、乙腈和丙酮的复溶效果。当使用异丙醇、甲醇和乙腈复溶时，不能完全溶解氮吹后的残渣，溶液比较浑浊。而用丙酮时能完全溶解残渣。因此选择丙酮作为复溶溶剂。

2.3 基质效应

质谱的基质效应是指样品中复杂的干扰物对分析物质谱响应的抑制或增强，可用基质标准曲线与标准校准曲线斜率的比值进行评估[19-20]。维生素A、维生素A棕榈酸酯、维生素A醋酸酯、维生素E、维生素E醋酸酯、维生素D3、维生素K1在奶粉基质中的基质效应比值分别为0.81、0.83、0.78、0.84、0.94、0.76、0.80，均小于1，表明脂溶性维生素的响应被样品中的干扰物质轻微抑制。因此为了减轻基质效应的影响，在配制标准工作液时应选择空白基质溶液进行配制。

2.4 线性关系和定量限

使用储备液，用空白基质溶液稀释成不同浓度的标准工作液，进行液相色谱-串联质谱分析。以标准工作液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标制作标准曲线，各脂溶性维生素的线性相关系数r≥0.99，见表3。

使用空白基质溶液对标准溶液进行稀释，直至化合物的峰高略大于10倍信噪比作为方法的定量限，各脂溶性维生素的定量限在（1~20）μg/100g之间，如表3所示。

表3 线性范围、相关系数及定量限

2.5 回收率和精密度

分别在空白奶粉基质中进行加标回收实验。其中加标浓度点的低点为0.5倍左右脂溶性维生素在婴幼儿奶粉中的平均添加量，中间点为脂溶性维生素在婴幼儿奶粉中的平均添加量，高点为1.5倍左右的平均添加量。每个加标水平进行6次重复，总体回收率在81.7%~99.8%之间，相对标准偏差在1.13%~6.33%之间，结果如表4所示。

表4 脂溶性维生素在奶粉基质中的回收率、精密度μg/100g

2.6 实际样品检测

采用本方法对市售的5批次婴幼儿配方奶粉中脂溶性维生素进行检测,见表5。所测得值均大于产品标签明示值，说明为了防止脂溶性维生素在货架期内降解，生产厂家对该类维生素进行了过量添加以保证产品质量。检测中发现婴幼儿奶粉中没有检测到维生素A，可能是由于维生素A稳定性较差[21-22]。所以企业主要以维生素A醋酸酯和维生素A棕榈酸酯的形式添加。

表5 实际样品检测 μg/100g

3 结 论

本文建立了一种使用液相色谱-串联质谱法测定婴幼儿奶粉中脂溶性维生素的方法。该方法在各自的范围内其线性相关系数≥0.99；维生素A、维生素A棕榈酸酯、维生素A醋酸酯、维生素E、维生素E醋酸酯、维生素D3、维生素K1定量限在1μg/100g~20μg/100g之间；方法在奶粉基质中的3个浓度水平具都有非常好的加标回收率和精密度，回收率在81.7%~99.8%之间，相对标准偏差为1.13%~6.33%。该方法适用于婴幼儿奶粉中脂溶性维生素的测定。