李佳阳,吴国真,王新茗,贾传青,王晓,陈龙,董红敬
1.齐鲁工业大学(山东省科学院)山东省分析测试中心,山东 济南 250014;2.云南中医药大学 中药学院,云南 昆明 650000;3.山东中医药大学 药学院,山东 济南 250355
天麻为兰科植物天麻Gastrodia elataBL.的干燥块茎,一般在立冬后至次年清明开始采挖,具有息风止痉、平肝抑阳、祛风通络的传统功效,用于小儿惊风、癫痫抽搐、头晕目眩、手足不遂、风湿痹痛等证[1]。天麻为中医临床上常用的名贵中药材,富含天麻素和巴利森苷类成分[2]。现代药理研究表明,巴利森苷类成分对神经系统疾病具有较好的药理活性,巴利森苷J 对记忆力减退疾病具有一定的成效,巴利森苷A 和巴利森苷C 对短期记忆具有改善作用[3]。近年来,许多学者就不同初加工方法对天麻品质的影响展开了深入研究,发现天麻炮制加工方法对巴利森苷类成分和天麻素有明显的影响,蒸制后的天麻中天麻素和巴利森苷类成分含量相对较高,品质也最好[4‑5]。目前,蒸制提高天麻品质的机制研究主要集中在“杀酶保苷”的层面上[5],并未见天麻中酶对其苷类成分降解作用的相关研究报道。天麻中巴利森苷A的含量较高[6],本实验研究不同方法初加工后天麻样品间的成分差异,并以巴利森苷A 为例,探讨温度和时间对降解酶活性的影响,采用葡聚糖凝胶G‑200 柱色谱法对粗酶进行了分离纯化,以期为天麻产地加工提供参考。
S6000 型高效液相色谱仪(华谱科仪北京科技有限公司);SCIENTZ‑10N 型冷冻干燥机、SB‑5200DT型超声波提取器(宁波新芝生物科技股份有限公司);SQP型十万分之一电子天平(塞多利斯科学仪器北京有限公司);TGL‑16A 型台式高速冷冻离心机(湖南平凡科技有限公司);JYL‑C21T 型料理机(九阳股份有限公司);UV‑2700 型紫外‑可见分光光度计(株式会社岛津制作所);H2O3‑PRO 型金属浴(卡尤迪生物科技宜兴有限公司);PowerPac型基础电泳仪电源、Mini‑Protean型小垂直板电泳槽(美国Bio‑Rad公司);CX‑S300型脱色摇床(上海舍岩仪器有限公司);ChemiScope 6200 Touch 型化学发光成像系统(上海勤翔科学仪器有限公司);BS‑100N 型自动部分收集器(上海沪西分析仪器厂有限公司);密理博Direct‑Q 型超纯水系统(美国默克公司)。
鲜天麻采自云南省昭通市彝良县小草坝天麻种植基地,经湖北中医药大学刘大会教授鉴定为兰科植物乌天麻Gastrodia elataBL.f.glauca的块茎。
对照品天麻素、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E(本实验室自制,纯度≥98%);对照品对羟基苯甲醇(纯度≥98%,批号:DSTDD012301,成都德思特生物技术有限公司);色谱纯乙腈(天津市康科德科技有限公司);分析纯丙酮(烟台远东精细化工有限公司);分析纯甲酸、磷酸氢二钠(Na2HPO4)和磷酸二氢钠(NaH2PO4)均购自天津市科密欧化学试剂有限公司;葡聚糖凝胶G‑200(上海源叶生物科技有限公司);4×蛋白上样缓冲液、聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)、透析袋(8000~14 000)、彩虹180 广谱蛋白Marker 均购自北京索莱宝科技有限公司;十二烷基磺酸钠‑聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS‑PAGE)试剂盒和电泳液均购自上海碧云天生物技术有限公司;考马斯亮蓝R250(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);去离子水为本实验室自制。
精密称取对照品天麻素、巴利森苷A、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷E 和对羟基苯甲醇各10 mg,置于50 mL量瓶中,加少量50%甲醇溶解后定容,得到质量浓度为200 μg·mL-1的各对照品储备溶液。分别取各对照品储备溶液0.1 mL,置于1.0 mL 量瓶中,加50%甲醇定容,作为混合对照品溶液,进行高效液相色谱法(HPLC)分析。
取1 块鲜天麻,洗净后竖向切制成4 等份,取3份分别编号后进行加工处理,具体加工方法如下:1)天麻蒸透,取出,沥干表面水分后,40 ℃烘干;2)将切制好的天麻块放入预热的40 ℃烘箱中烘干;3)放入-20 ℃冰箱中充分冷冻后,再放入冷冻干燥机进行干燥。将以上干燥好的样品分别粉碎后过40目筛,备用。
称取去皮鲜天麻约500 g,切碎,用料理机均质成匀浆。向匀浆中加入预冷的丙酮(-20 ℃)1000 mL,搅拌混匀后,在4 ℃冰箱中密封静置2 h。将静置后的溶液用布氏漏斗进行抽滤,滤饼用预冷的丙酮8000 mL 反复溶解后进行抽滤,得滤饼。将滤饼置于蒸发皿中,室温下放置于通风橱中让丙酮挥发,即得天麻丙酮干粉。向丙酮干粉中加入预冷的Na2HPO4‑NaH2PO4(0.05 mol·L-1,pH 6.0,下同)缓冲液400 mL,并加入质量为丙酮干粉质量的5%的PVPP,充分研磨后在4 ℃冷藏柜中静置2 h。纱布滤过,取滤液,冷冻离心10 min(10 000 r·min-1,4 ℃,离心半径为9.1 cm),收集上清液,采用透析袋将上清液在缓冲溶液(4 ℃)中透析24 h(每4 h更换1次透析液),得天麻粗酶液。
参考《中华人民共和国药典》2020 年版的方法对天麻样品进行提取[1]。分别精密称取不同干燥方法得到的天麻药材粉末0.5 g,置于50 mL 具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇25 mL,超声处理30 min,放冷,补足减失的质量后摇匀,滤过,取续滤液作为供试品溶液,过0.45 μm滤膜,进行HPLC分析。
Waters Symmetry C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为0.05% 甲酸乙腈溶液(A)‑0.05%甲酸水溶液(B);梯度洗脱(0~10 min,3%~10%A;10~15 min,10%~12%A;15~25 min,12%~18%A;25~40 min,18%A);流速:1.0 mL·min-1;柱温:25 ℃;检测波长:225 nm;进样体积:20 μL。
采用2.1项下方法,以Na2HPO4‑NaH2PO4缓冲液为溶剂,制备质量浓度为200 μg·mL-1的巴利森苷A储备溶液。
精密量取2.3 项下粗酶液2 份,每份2.7 mL,分别加入巴利森苷A 储备溶液和Na2HPO4‑NaH2PO4缓冲液0.3 mL,作为供试组和酶对照组。分别将2 组样品在35 ℃水浴条件下磁力搅拌反应2 h后,向每组中各加乙腈3 mL,涡旋混匀1 min,使酶蛋白沉淀,终止反应。样品离心10 min(8000 r·min-1,离心半径为8.75 cm),取上清液4 mL,用氮吹仪吹干后,加去离子水2 mL 溶解,溶液过0.45 μm 滤膜后,进行HPLC分析。
另精密量取Na2HPO4‑NaH2PO4缓冲液2.7 mL,加入巴利森苷A 储备溶液0.3 mL,作为巴利森苷A对照组。按照供试组及酶对照组的制备方法对样品进行处理。
精密量取2.3项下粗酶液和Na2HPO4‑NaH2PO4缓冲溶液各6.3 mL,分别放入20 mL 的圆底烧瓶中,向2组样品中各加入2.6项下的巴利森苷A储备溶液0.7 mL,作为供试组和巴利森苷A 对照组。2 组均在35 ℃水浴条件下进行磁力搅拌反应,分别在反应10、20、30、60、120、180 min 后,取反应液1 mL,按照2.6项下方法处理样品,用于HPLC分析。
大多数生物酶在40~50 ℃时具有较高的活性,温度过高或过低都会影响酶的活性[7],因此本研究考察了35、45、55、65、75 ℃共5 个不同温度对巴利森苷A降解酶活性的影响。
分别精密量取2.3 项下的粗酶液2.7 mL 和Na2HPO4‑NaH2PO4缓冲液2.7 mL各5份,放入10 mL玻璃小瓶中称定质量,取以上样品分别在35、45、55、65、75 ℃的水浴条件下孵育20 min,去离子水补足减失的质量。在每份样品中均加入2.6 项下的巴利森苷A 储备溶液0.3 mL,称定质量,继续孵育2 h 后,放凉至室温,去离子水补足减失的质量,作为供试组和巴利森苷A 对照组。按照2.6 项下方法处理样品,用于HPLC分析。
葡聚糖凝胶G‑200常规处理后采用自然沉降法装柱(100 mm×16 cm),用预冷的Na2HPO4‑NaH2PO4缓冲液在4 ℃冷藏柜中平衡过夜。将2.3 项下得到的粗酶液每4 mL 分装1 管,冷冻干燥。取10 管冻干样品溶于去离子水2 mL 中,在4 ℃下用Na2HPO4‑NaH2PO4缓冲液透析平衡盐离子浓度,过0.45 μm滤膜后上样。采用自动部分接收器收集样品,洗脱液为Na2HPO4‑NaH2PO4缓冲液,流速为0.1 mL·min-1,每管收集2 mL。洗脱结束后采用紫外‑可见分光光度计测定每份样品在280 nm 处的吸光度,并绘制色谱图,根据色谱图合并各流分,进一步采用超滤离心管对各色谱峰样品进行浓缩。采用2.6 项下方法测定各色谱峰组分对巴利森苷A的降解作用。
取2.9项下所得的酶溶液经SDS‑PAGE进行纯度鉴定。电泳条件:浓缩胶为5%,电压为80 V,电泳时间为25 min;分离胶为10%,电压为120 V,电泳时间为110 min;上样体积15 μL。电泳结束后,凝胶用考马斯亮蓝R250染色。脱色后用化学发光成相系统拍照。
不同加工方式制备的天麻供试品HPLC 图见图1,40 ℃低温烘干组天麻样品中对羟基苯甲醇(峰2)的峰面积显著增加,而其他色谱峰均明显减少或消失(图1A)。蒸后40 ℃烘干组(图1B)和冷冻干燥组(图1C)样品中出现6 个相同的色谱峰,经过与对照品比对分析,确认峰1~6 分别为天麻素、对羟基苯甲醇、巴利森苷E、巴利森苷B、巴利森苷C 和巴利森苷A,且蒸后40 ℃烘干组天麻中巴利森苷A 的峰面积明显高于冷冻干燥组;而冷冻干燥组天麻样品中对羟基苯甲醇的色谱峰面积高于蒸后40 ℃烘干组样品。以上结果说明,鲜天麻中可能含有降解苷类成分的酶,推测不同加工方式获得的天麻样品中酶活性不同。蒸制产生的高温使天麻中的酶迅速失活,阻止了酶对苷类成分的降解;冷冻干燥后的天麻仍具有一定的酶活性,在50%甲醇提取液中,部分苷类成分发生酶解反应,因此巴利森苷A 的含量低于蒸后40 ℃烘干组天麻,对羟基苯甲醇的含量相对较高;鲜天麻在低温烘干过程中具有较高的酶活性,其中的苷类成分逐渐降解为苷元。
图1 不同加工方式的天麻样品及对照品HPLC图
结果表明(图2),在酶的作用下巴利森苷A 可降解出2 种产物,与对照品色谱图相比,峰1 和峰2分别为对羟基苯甲醇和巴利森苷B,说明天麻中含有降解巴利森苷A 的酶。结合不同干燥方式天麻中化学成分变化情况,在酶的作用下天麻中天麻素及巴利森苷类成分的降解过程见图3,其中,在自身酶的作用下,巴利森苷A 的降解产物主要为对羟基苯甲醇和巴利森苷B 已经得到证实,而巴利森苷A在降解过程中是否也产生巴利森苷C、巴利森苷E及天麻素等产物还有待进一步研究。
图2 巴利森苷A酶解反应产物及空白对照HPLC图
图3 天麻中天麻素及巴利森苷类成分降解途径
孵育温度为35 ℃时,孵育时间对巴利森苷A 色谱峰面积的影响情况见图4A,随着孵育时间的延长,巴利森苷A 的色谱峰面积逐渐下降,180 min后巴利森苷A 的色谱峰面积由708 降低为88。说明随着酶与巴利森苷A 作用时间的延长,巴利森苷A 的降解程度也愈发显著。
孵育时间为2 h时,孵育温度对巴利森苷A 色谱峰面积的影响情况见图4B,在孵育时间相同的条件下,随着孵育温度的升高,巴利森苷A 的峰面积呈现出先下降后上升的趋势。温度达到45 ℃时,巴利森苷A 的峰面积最低,说明此时降解酶活性最高;随着温度的升高,巴利森苷A 的峰面积逐渐升高,说明降解酶活性在逐渐降低;至75 ℃时,与巴利森苷A对照组(峰面积为721)比较,供试组巴利森苷A 的峰面积略有降低,说明在75 ℃的时候,酶基本失活,而减少的峰面积可能是由于巴利森苷A 的热不稳定性导致的[8]。
图4 孵育时间、温度对天麻中巴利森苷A峰面积的影响
由葡聚糖凝胶G‑200 柱色谱收集到的酶流分在280 nm 下的吸光度变化情况见图5。显示酶流分的吸光度从第13 管开始上升,在第13~19 管出现第1个峰(峰a),从第20 管开始吸光度迅速上升,于第25 管达到最大值后下降,在第20~35 管出现第2 个峰(峰b),而后吸光度逐渐下降,趋近于0。
图5 葡聚糖凝胶G-200柱色谱分离后天麻粗酶液各流分吸光度
通过比较峰a和峰b流分对巴利森苷A 的降解作用,发现峰a 流分对巴利森苷A 有较强的降解活性。峰a 流分对巴利森苷A 酶解反应及巴利森苷A 对照的HPLC 图(图6)显示,在峰a 流分的作用下巴利森苷A 发生降解反应,与对照品色谱图对比,确认降解产物为对羟基苯甲醇。通过以上结果可以推测出天麻中含有降解巴利森苷A 的酶。在同样的反应条件下,比较粗酶液与峰a 流分对巴利森苷A 的降解作用,发现峰a 流分可使巴利森苷A 全部降解为对羟基苯甲醇,推测可能是由于经过纯化后其酶活性得到提高。进一步采用外标一点法对产物中羟基苯甲醇的含量进行了计算,酶反应后样品中对羟基苯甲醇的浓度为0.06 mmol·L-1,因此巴利森苷A转化为对羟基苯甲醇的摩尔转化率为300%。
图6 天麻粗酶液流分a对巴利森苷A的酶解反应HPLC图
峰a 流分的SDS‑PAGE 凝胶电泳结果见图7,可以看出经过葡聚糖凝胶G‑200 柱色谱纯化后除去了大部分的杂蛋白,在峰a的位置上得到了3条明显且清晰的条带,相对分子质量分别约为75 000、60 000和48 000。
图7 天麻粗酶液流分a的SDS-PAGE图
在提取粗酶时,本研究考察了柠檬酸‑Na2HPO4、Na2HPO4‑NaH2PO4等缓冲液对天麻粗酶的提取效果,发现直接采用缓冲溶液对酶进行提取,随着透析时间的延长,透析袋内溶液逐渐浑浊,并且粗酶液的活性随着沉淀的析出而逐渐降低。推测是由于鲜天麻中含有大量的脂类、多糖等生物大分子,在透析的过程中,降解酶可能会随着这些成分一起沉淀下来,不利于天麻粗酶的存储。通过优化提取方法,发现采用丙酮沉淀法对粗酶液进行提取后,酶液未出现沉淀,且具有较高的降解活性,为天麻中相关酶的发现提供了方法学参考。
本研究以巴利森苷A 为例,从鲜天麻中发现并提取了可降解苷类成分的酶,进一步考察了温度和时间对其活性的影响,发现在45 ℃时,酶的活性最高。通过凝胶柱色谱、超滤等分离方法,从天麻中发现了对巴利森苷A 有降解活性的酶,经过SDS‑PAGE 鉴定,其相对分子质量为48 000~75 000。以上研究结果证明鲜天麻中的酶对巴利森苷A 的含量有重要影响,可一定程度上揭示天麻饮片质量差异较大的原因,同时为天麻中苷类成分降解酶的特性研究、其他巴利森苷类成分的降解途径、鲜天麻的储存及产地加工方法的改进提供参考。