UPLC‑MS/MS分析及NMR技术鉴定千金子中二萜类化合物△

孙明娜，吴孟华，陈虎彪，林敏婷，刘韵，张玲玲，张建业*

1.广州医科大学 药学院/附属第五医院 广东省分子靶标与临床药理学重点实验室，广东 广州 511436；2.暨南大学 药学院，广东 广州 510632；3.香港浸会大学 中医药学院，香港特别行政区

中药及天然产物在药物开发和应用中占有举足轻重的地位，是先导化合物的重要来源之一[1]。全球批准上市的抗癌药物中73%非合成所得，其中47%是天然产物或其衍生物[2‑4]。传统中药千金子是大戟科植物续随子Euphorbia lathyrisL.的干燥成熟种子，用于二便不通、水肿、痰饮、积滞胀满、血瘀经闭[5]。其化学成分主要有脂肪油、蛋白质、甾醇、二萜酯及游离二萜醇、香豆素等。现已发现的多种二萜类化合物千金子素（euphorbia factor，EF）L1～L25等，其中EFL1、EFL2、EFL3含量最高约占0.2%～0.4%。现代药理学及临床研究表明，千金子中的二萜类成分具有一定的抗肿瘤活性[6‑7]。

本课题组前期进行了千金子中二萜类成分的提取分离，发现EFL1、EFL2 和EFL3 具有明显的抗肿瘤作用。最初，发现EFL1 对人口腔表皮样癌细胞KB、口腔表皮样癌耐药细胞KBv200、人乳腺癌细胞MCF‑7 及人乳腺癌耐阿霉素细胞MCF‑7/ADR 等肿瘤细胞具有显著的增殖抑制作用[8]；随后发现EFL1 具有逆转ATP 结合盒蛋白亚家族B 成员1（ATP‑binding cassette subfamily B member 1，ABCB1）介导的KBv200 及MCF‑7/ADR 细胞多药耐药（multidrug resistance，MDR）的活性，但并不影响该细胞对化学治疗药的敏感性[9]；此外，EFL1 可降低抗癌药对ABCB1高表达的人白血病阿霉素耐药细胞K562/ADR 的半数抑制浓度（IC50），并可通过线粒体途径增敏细胞K562/ADR 的凋亡[10]；再者，EFL1 也可增加活性氧的释放、降低线粒体膜电位、释放细胞色素C（cytochrome C，Cyt C），从而诱导人肺癌细胞A549的凋亡[11]。本课题组也发现，EFL2和EFL3 对肺癌A549 细胞有显著的抑制作用，其作用机制与通过线粒体途径诱导凋亡相关[12‑13]。为了进一步探讨千金子中的药效物质基础，本研究采用超高效液相色谱‑质谱法（UPLC‑MS/MS）分析与传统的乙醇回流提取及色谱分离相结合的方法研究千金子乙酸乙酯提取部分的化学成分，并利用分离所得化合物的核磁共振（NMR）数据验证UPLC‑MS/MS的分析结果。

1 材料

1.1 试剂

分析纯有机溶剂如乙醇、甲醇、三氯甲烷、二氯甲烷、环己烷、正丁醇、乙酸乙酯、石油醚均购自广州佳钻生物科技有限公司；色谱纯试剂如甲醇、乙腈购自广州威佳科技有限公司；柱色谱硅胶（200～300 目，青岛海洋化工有限公司）；Sephadex LH‑20 型葡聚糖凝胶（瑞士Pharmacia Biotech 公司）；千金子购自河北安国药材市场，经香港浸会大学陈虎彪教授鉴定为大戟科续随子EuphorbialathyrisL.的干燥成熟种子，标本保存于广州医科大学药学院植物标本室；对照品EFL1、EFL2、EFL3为自制样品，纯度均大于99%。

1.2 仪器

1290 型超高效液相测谱仪、G6540A 型飞行时间质谱仪（Agilent Technologies 公司）；质谱分析软件为Agilent MassHunter（G3336‑60048）；工作站软件为Qualitative Analysis B.06.00；Inova‑500 NB 型核磁共振仪、Inova‑400 NB 型核磁共振仪（美国Varian公司）。

2 方法

2.1 提取分离

取千金子药粉16 kg，用95%乙醇（4 L·kg-1）加热回流，提取3 次，每次3 h。合并提取液后减压浓缩得浸膏。将浸膏混悬于蒸馏水中，依次用环己烷（4 L）和乙酸乙酯（4 L）提取（各3 次）。乙酸乙酯层减压浓缩后，进行硅胶柱色谱（石油醚‑乙酸乙酯洗脱）和Sephadex LH‑20 柱色谱（二氯甲烷‑甲醇洗脱）分离。

2.2 样品制备

分别称取EFL1、EFL2、EFL3、千金子乙酸乙酯提取部分0.1 mg，溶解于10 μL三氯甲烷中，再用色谱甲醇稀释至1 mL，得对照品溶液和供试品溶液。

2.3 色谱条件

ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；ACQUITY Van Guard BEH C18色谱柱（5 mm×2.1 mm，1.7 μm）；检测波长分别为210、230、250、280 nm；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）‑0.1%甲酸乙腈溶液（B）；梯度洗脱（0～15 min，45%～80%B；15～18 min，80%B；18～22 min，80%～45%B）；流速为1 mL·min-1；进样体积为1.0 μL。

2.4 质谱条件

离子源为喷射流电喷雾离子源（AJS ESI）；脱溶剂气温度为300 ℃；脱溶剂气流速为7.0 L·min-1；雾化气压力为45 psi（1 psi≈6.895 kPa）；鞘气温度为350 ℃；鞘气流速为10.0 L·min-1；帽电压为4000 V；喷嘴电压为0 V；碎裂电压为140 V；分离锥电压为65.0 V；八级杆透射峰电压为750 V。

2.5 核磁共振实验条件

用氘代三氯甲烷（CDCl3）作为溶剂，并以四甲基硅烷（TMS）作为参考物质；相对于TMS 的化学位移（δ）；处理分析软件为MestReNova V12.0.0。

3 结果

3.1 UPLC‑MS/MS分析

千金子乙酸乙酯提取部分和对照品（EFL1、EFL2、EFL3）的离子流色谱见图1，千金子乙酸乙酯提取部分离子流图中主要有12个峰。

图1 千金子素对照品及千金子乙酸乙酯提取物的总离子流色谱

3.2 UPLC‑MS/MS鉴定结构

根据每个峰对应的二级质谱数据，结合参考文献已报道的千金子二萜类化合物的信息[8,11,13‑20]，并与对照品EFL1、EFL2、EFL3 的UPLC‑MS/MS 进行对比，鉴定出12 种千金子二萜类化合物，分别为化合物1～12，鉴定结果见表1，化合物结构式见图2。千金子中二萜成分的结构中含多个酯键，其质谱信息中多为脱除中性小分子羧酸的碎片离子。在本研究所采用的离子源条件下，各化合物的分子离子及碎片离子均可检测到加氢和加钠离子信号，加氢信号离子的丰度更大，本研究主要通过加氢离子信号分析鉴定各化合物。分析3 种对照品的质谱裂解规律，为了与参考文献对比，故采用了加钠离子信号。EFL3的质谱裂解规律（图3）：分子离子峰为m/z545［M+Na］+，脱除1 分子乙酸得m/z485；脱除2 分子乙酸得m/z425；脱除1 分子苯甲酸得m/z423；脱除1分子乙酸和1分子苯甲酸得m/z363；脱除2分子乙酸和1 分子苯甲酸得m/z303，质谱裂解规律与参考文献［14‑15］相一致。

图2 千金子素乙酸乙酯提取物中化合物1～12的化学结构

图3 EFL3的质谱裂解规律

EFL2 的质谱裂解规律：分子离子峰为m/z665［M+Na］+，脱除1 分子乙酸得m/z605；脱除2 分子乙酸得m/z545；脱除1 分子苯甲酸得到m/z543；脱除1分子乙酸和1分子苯甲酸得m/z483；脱除2分子乙酸和1分子苯甲酸得m/z423；脱除1分子乙酸和2分子苯甲酸得m/z361；脱除2 分子乙酸和2 分子苯甲酸得m/z301（图4），与参考文献［14,16］相一致。

图4 EFL2的质谱裂解规律

EFL1 的质谱裂解规律：分子离子峰为m/z575［M+Na］+，脱除1 分子乙酸得m/z515；脱除2 分子乙酸得m/z455；脱除1 分子苯乙酸得m/z439；脱除1分子乙酸和1分子苯乙酸得m/z379；脱除2分子乙酸和1 分子苯乙酸得m/z319（图5），与参考文献［14］相一致。

图5 EFL1的质谱裂解规律

参考EFL1、EFL2、EFL3 的质谱裂解规律[14‑16]，本研究实验中千金子乙酸乙酯提取部分12 种化合物的总离子流色谱图见图1D，质谱信息见表1。化合物1 的保留时间（tR）为8.754 min，分子离子峰为m/z539［M+H］+，分子式为C31H38O8。二级质谱为m/z419［M+H-120］+，m/z417［M+H-122］+，m/z357［M+H-182］+，m/z297［M+H-242］+，产生脱去120、122、182、242 个质量单位的碎片离子，基本可以推断分子中含有2个乙酸酯片段和1个苯甲酸酯片段。基于以上数据和文献报道信息[17]，鉴定化合物1为EFL25。

表1 千金子乙酸乙酯提取部分12种化合物的质谱数据

化合物2 的tR为9.339 min，分子离子峰为m/z553［M+H］+，分子式为C32H40O8。二级质谱为m/z493［M+H-60］+，m/z417［M+H-136］+，m/z357［M+H-196］+，m/z297［M+H-256］+，产生脱去60、136、196、256 个质量单位的碎片离子，基本可以推断分子中含有2个乙酸酯片段和1个苯乙酸酯片段。基于以上数据和文献报道信息[8,11,17‑19]，结合化合物2的质谱信号与EFL1对照品在tR9.342 min 的信号一致，鉴定化合物2为EFL1。

化合物3 的tR为9.506 min，分子离子峰为m/z495［M+H］+，分子式为C30H38O6。二级质谱为m/z435［M+H-60］+，m/z359［M+H-136］+，m/z299［M+H-196］+，产生脱去60、136、196个质量单位的碎片离子，基本可以推断分子中含有1个乙酸酯片段和1个苯乙酸酯片段。基于以上数据和文献报道信息[17]，鉴定化合物3为EFL13。

化合物4的tR为9.598 min，分子离子峰为m/z581［M+H］+，分子式为C33H40O9。二级质谱为m/z521［M+H-60］+，m/z461［M+H-120］+，m/z401［M+H-180］+，m/z339［M+H-242］+，m/z279［M+H-302］+，产生脱去60、120、180、242、302个质量单位的碎片离子，基本可以推断分子中含有3 个乙酸酯片段和1 个苯甲酸酯片段。基于以上数据和文献报道信息[17]，鉴定化合物4为EFL7b。

化合物5的tR为9.915 min，分子离子峰为m/z481［M+H］+，分子式为C29H36O6。二级质谱为m/z421［M+H-60］+，m/z359［M+H-122］+，m/z299［M+H-182］+，产生脱去60、122、182个质量单位的碎片离子，基本可以推断分子中含有1个乙酸酯片段和1个苯甲酸酯片段。基于以上数据和文献报道信息[17]，鉴定化合物5为EFL12或其异构体。

化合物6的tR为10.149 min，分子离子峰为m/z537［M+H］+，分子式为C32H40O7。二级质谱为m/z477［M+H-60］+，m/z417［M+H-120］+，m/z401［M+H-136］+，m/z341［M+H-196］+，m/z281［M+H-256］+，产生脱去60、120、136、196、256个质量单位的碎片离子，基本可以推断分子中含有2 个乙酸酯片段和1 个苯乙酸酯片段。基于以上数据和文献报道信息[17]，鉴定化合物6为EFL18。

化合物7的tR为10.842 min，分子离子峰为m/z523［M+H］+，分子式为C31H38O7。二级质谱为m/z463［M+H-60］+，m/z403［M+H-120］+，m/z401［M+H-122］+，m/z341［M+H-182］+，m/z281［M+H-242］+，产生脱去60、120、122、182、242个质量单位的碎片离子，基本可以推断分子中含有2 个乙酸酯片段和1 个苯甲酸酯片段。基于以上数据和文献报道信息[17]，推测化合物7可能为EFL3或EFL17。

化合物8的tR为11.259 min，分子离子峰为m/z523［M+H］+，分子式为C31H38O7。二级质谱为m/z463［M+H-60］+，m/z403［M+H-120］+，m/z401［M+H-122］+，m/z341［M+H-182］+，m/z281［M+H-242］+，产生脱去60、120、122、182、242个质量单位的碎片离子，基本可以推断分子中含有2 个乙酸酯片段和1 个苯甲酸酯片段。基于以上数据和文献报道信息[17]，推测化合物8可能为EFL3或EFL17。

为了确证化合物7和8的具体结构，利用实验室自制的EFL3 对照品在相同色谱条件下测得tR为11.269 min，与化合物8 的tR11.259 min 非常接近，故鉴定化合物8为EFL3[13,15,17,19]，化合物7为EFL17。

化合物9的tR为11.928 min，分子离子峰为m/z549［M+H］+，分子式为C33H40O7。二级质谱为m/z489［M+H-60］+，m/z429［M+H-120］+，m/z401［M+H-148］+，m/z341［M+H-208］+，m/z281［M+H-268］+，产生脱去60、120、148、208、268个质量单位的碎片离子，基本可以推断分子中含有2 个乙酸酯片段和1 个肉桂酸酯片段。基于以上数据和文献报道信息[17]，鉴定化合物9为EFL7a。

化合物10的tR为12.830 min，分子离子峰为m/z517［M+H］+，分子式为C30H44O7。二级质谱为m/z457［M+H-60］+，m/z401［M+H-116］+，m/z397［M+H-120］+，m/z341［M+H-176］+，m/z281［M+H-236］+，产生脱去60、116、120、176、236个质量单位的碎片离子，基本可以推断分子中含有2 个乙酸酯片段和1 个正己酸酯片段。基于以上数据和文献报道信息[17]，鉴定化合物10为EFL23。

化合物11的tR为13.055 min，分子离子峰为m/z601［M+H］+，分子式为C36H40O8。二级质谱为m/z541［M+H-60］+，m/z479［M+H-122］+，m/z419［M+H-182］+，m/z297［M+H-304］+，m/z279［M+H-H2O-304］+，产生脱去60、122、182、304、322个质量单位的碎片离子，基本可以推断分子中含有1 个乙酸酯片段和2 个苯甲酸酯片段。基于以上数据和文献报道信息[20]，鉴定化合物11为EFL11。

化合物12的tR为13.205 min，分子离子峰为m/z643［M+H］+，分子式为C38H42O9。二级质谱为m/z583［M+H-60］+，m/z523［M+H-120］+，m/z521［M+H-122］+，m/z461［M+H-182］+，m/z401［M+H-242］+，m/z339［M+H-304］+，m/z279［M+H-364］+，产生脱去60、120、122、182、242、304、364 个质量单位的碎片离子，基本可以推断分子中含有2 个乙酸酯片段和2 个苯甲酸酯片段。基于以上数据和文献报道信息[16‑19]，结合其质谱信号与EFL2 对照品在tR13.183 min 的信号一致，鉴定化合物12 为EFL2。

3.3 NMR鉴定结构

为了进一步证实UPLC‑MS/MS 所鉴定的化合物结构，本研究进行了组分纯化和NMR 结构鉴定，具体的1H‑、13C‑及2D‑NMR（HMBC、DEPT）数据见表2。化合物12 为从二氯甲烷中重结晶得到的无色晶体。经高分辨质谱分析，化合物12 的分子式为C38H42O9，m/z643.292 2［M+H］+。化合物12的1H‑NMR 谱显示在δ7.20～8.10 有10 个芳氢信号；δ5.20～6.50有6个烯氢信号或环上连氧氢信号。13C‑NMR 谱显示有34 个碳信号；DEPT 谱显示化合物12 有6 个甲基碳、3 个亚甲基碳、14 个次甲基碳和11 个季碳信号，提示化合物12 含有2 个单取代的苯环。13C‑NMR 谱还显示有5 个羰基碳信号，其中1 个酮羰基碳δ197.3（C‑14），2 个乙酰氧基碳δ169.4、169.1，2 个苯甲酰基碳δ165.8、165.3，4个连氧的碳δ64.0（C‑5）、78.4（C‑7）、79.4（C‑3）、91.8（C‑15）。HMBC 图谱（图6）上可观察到C‑3 位质子δH5.74 与δC47.7（C‑1），δC165.8（C‑1′），δC91.8（C‑15）相关，提示C‑3 位连接了苯甲酰氧基；C‑5 位质子δH6.36 与δC52.7（C‑4），δC141.8（C‑6），δC91.8（C‑15），δC169.1（5‑AcCO）相关，提示C‑5 位连接了乙酰氧基；剩余的1 个乙酰氧基和1 个苯甲酰氧基连在C‑7 和C‑15 位，结合文献［16‑19］报道信息，C‑15 位应连接乙酰氧基，C‑7 位应连接苯甲酰氧基。此外，C‑7 位质子δH5.51 与δC64.0（C‑5），δC141.8（C‑6），δC28.6（C‑8），δC31.3（C‑9），δC119.5（C‑17）相关；C‑20位质子δH1.78与δC142.5（C‑12），δC135.3（C‑13），δC197.3（C‑14）相关；C‑16 位质子δH0.90与δC47.7（C‑1），δC37.4（C‑2），δC79.4（C‑3）相关。以上数据显示，化合物12 的2D‑NMR 数据与文献报道的EFL2的数据一致[16‑19]。

图6 化合物12的化学结构及主要HMBC（H→C）

表2 化合物12的13C-NMR、DEPT、1H-NMR及HMBC数据

4 讨论

传统提取分离是研究天然产物中化学成分的常用方法，而UPLC‑MS/MS 是研究天然产物中复杂成分的有效方法[14]。本研究将两者结合用于研究千金子中的活性成分，对乙酸乙酯提取部分进行UPLC‑MS/MS 分析，得到12 个成分，根据相对分子质量、分子式以及各碎片离子的信息，并与文献报道的千金子中已知二萜类成分进行比对，鉴定上述12 种千金子二萜成分。化合物1 和2 的质谱信息中均含有m/z297，推测其含有母核A（脱除3 分子水后得m/z296 的片段）（图7），根据脱除的2 个质量单位为60 的中性小分子可知其均含2 个乙酰基，此外，化合物1 中含有1 个苯甲酰基，化合物2 中含有1 个苯乙酰基，检索相关类似物，发现含有此类母核的化合物中，乙酰基均位于5 和15 位，再结合相对分子质量判断化合物1 为EFL25，化合物2 为EFL1。同理，化合物3 和5 的质谱信息中均含有m/z299，推测其含有母核B（脱除2分子水后得相对分子质量为298 的片段）（图7），根据脱除的1 个质量单位为60 的中性小分子可知其均含1 个乙酰基，此外，化合物3 中含有1 个苯乙酰基，化合物5 中含有1 个苯甲酰基，经检索相关类似物，发现含有此类母核的化合物中，苯乙酰基均出现于3位，故判断化合物3为EFL13；苯甲酰基可位于3 位和15 位，故判断化合物5 为EFL12 或其异构体。化合物4、11 和12 的质谱信息中均含有m/z279，推测其含有母核C 或F（脱除4分子水后得相对分子质量为278的片段）（图7），根据脱除的3 个质量单位为60 的中性小分子可知化合物4 中含有3 个乙酰基和1 个苯甲酰基，经检索，含母核F的化合物中均不具有3个乙酰基，故化合物4的母核应为C，结合相对分子质量，判断其为EFL7b；根据脱除的2 个质量单位为122 的中性小分子可知化合物11 和12 中含有2 个苯甲酰基，经检索，含母核F的化合物含有2个苯甲酰基，且苯甲酰基分别位于3位和7位，结合相对分子质量判断化合物11 为EFL11，化合物12 为EFL2，且化合物11 和12在UPLC‑MS中保留时间较长，可能是因为含2个苯甲酰基导致极性较小。化合物6～10 的质谱信息中均含有m/z281，推测其含有母核D 或E（脱除3 分子水后得相对分子质量280的片段）（图7），根据脱除的中性小分子可知化合物6、9、10 中分别含有1个苯乙酰基、肉桂酰基、正己酰基，经检索，含母核D 的化合物中3 位可见苯乙酰基、肉桂酰基和正己酰基，故判断化合物6、9、10 分别为EFL18、L7a 和L23；化合物7 和8 在UPLC‑MS/MS 中具有相同的相对分子质量和碎片离子信息，本文通过对照品比对将化合物8 鉴定为EFL3，将化合物7 鉴定为EFL17。NMR 技术广泛用于化合物的结构确证，本文也通过NMR 证实了UPLC‑MS/MS 的鉴定结果，即化合物12 为EFL2。本文研究表明，基于对照样品的UPLC‑MS/MS 分析法结合传统提取分离法是用于研究千金子乙酸乙酯提取部分化学成分的有效方法。

图7 推测的12种成分所含的萜类母核