体外消化前后EGCG 对肠道菌群组成的影响

李浩楠，雷嗣超，辜 煊，谢辰阳，李 杰，杨 芳,2,3，张 美

（1.武汉工程大学环境生态与生物工程学院，湖北武汉 430205；2.武汉工程大学绿色化工过程教育部重点实验室，湖北武汉 430205；3.磷资源开发利用教育部工程研究中心，湖北武汉 430073）

表没食子儿茶素没食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）是从中国绿茶中提取的一种成份，是绿茶茶多酚中含量最丰富的儿茶素类单体物质。它是绿茶主要的活性和水溶性成份，是儿茶素中含量最高的组分，占绿茶毛质量的9%～13%。因为具有特殊的立体化学结构，EGCG 具有非常强的抗氧化活性，抗氧化活性至少是维生素C 的100 多倍，是维生素E 的25 倍，能够保护细胞和DNA 受损害，这种损害与癌症、心脏疾病和其他重大疾病有关。EGCG 具有多种生理功能，如抗炎、抗癌、抗氧化等[1-2]，对生物体起到促生长、缓解氧化应激和炎症损伤等作用[3]，在食品工业上可作抗氧、抑菌、保鲜、祛臭剂;在日化产品上作特殊功能的保质剂、护肤剂。

近年来的研究表明，EGCG 对肝癌、胃癌、食管癌、鼻咽癌、乳腺癌以及宫颈癌等均有显著的抑制效果，且不良反应较小[3-4]。有研究发现，EGCG 可通过抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡、调节自噬活性、抑制肿瘤细胞侵袭和迁移、抗血管形成、逆转肿瘤细胞耐药等方面发挥其抗肿瘤效应[5-7]。然而，由于胃肠消化过程对EGCG 结构的影响导致其功能活性的变化，其生物利用率较低。另一方面，肠道是机体内最大的微生态系统，70%以上的免疫功能都与其有关，成为保护机体健康的天然屏障[8]。动物肠道内菌群的数量、组成及相互作用直接影响机体的健康[9]。因此，肠道菌群的变化可以用于分析功能因子在体内的活性变化。本文模拟体外消化前后的EGCG，研究其对大鼠肠道菌群的影响，探讨了EGCG 在消化过程中的变化情况及其对肠道菌群的影响，为提高EGCG 的生物利用率及生物活性等提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

EGCG，杭州禾田生物技术有限公司；厌氧培养基，青岛高科园海博生物技术有限公司；氯化钠（AR），国药集团化学试剂有限公司；PBS、DNA 聚合酶，北京索莱宝科技有限公司；DNA 抽提试剂盒，Omega 公司；甲醇（色谱纯）、乙醇（色谱纯），德国默克公司；Sprague Dawley（SD）大鼠粪便，武汉金开瑞生物工程有限公司；胃蛋白酶、盐酸、胰蛋白酶、胆盐、氢氧化钠、碳酸氢钠，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

超净工作台，SW-CJ-1D 型，苏州智净净化设备有限公司；二氧化碳培养箱，311 型，Thermo 公司；PCR 仪，9700 型，Thermo 公司；酶标仪，AMR-100 型，杭州奥盛仪器有限公司；基因测序仪，MiSeq 型，美国Illumina 公司。

1.2 方法

1.2.1 EGCG 和EGCG-GIT 的制备

EGCG 标准溶液的配制：准确称取400 mg EGCG 标准品，用无水乙醇溶解后定容于100 mL 容量瓶中，即得4 mg/mL 的EGCG 标准溶液。

EGCG-GIT 标准溶液的制备：取0.5 mL ECCG 标准溶液加入4 mL 活性蛋白酶液（0.9 mol/L NaCl 配置4 mg/mL 胃蛋白酶溶液，0.1 mol/L 盐酸调pH 至2.1），在250 r/min、7 ℃的摇床中消化2 h。然后加入3.6 mL 活性胰液-胆汁混合物（225 mg 胰蛋白酶、225 mg 胆盐溶于90 mL NaCl 溶液，用0.1 mol/mL NaOH 调pH 至7.0～7.2，用NaCl 定容于100 mL 容量瓶），用0.1 mol/L 碳酸氢钠溶液调节pH 在7.0～7.5，在100 r/min、37 ℃的摇床中振荡2 h。而后在4 000 r/min 的离心机中离心10 min，取上清液定容至10 mL，记作EGCG-GIT。

1.2.2 肠道菌群的制备

参考黄小霞等[10]的方法，稍作修改。

将采集的SD 大鼠粪便解冻，在无菌操作条件下，粪便与生理盐水按1∶4（g/mL）比例混合均匀，使用涡旋仪蜗旋2 min，用4 层无菌纱布过滤，滤液即为肠道菌液。按1∶9 的比例将肠道菌液加入BBL 琼脂厌氧培养基中，混匀，液体石蜡液封后置于干燥器（含厌氧产气包）中37 ℃培养24 h，得培养液，以3%比例进行二次扩大培养，得到肠道菌悬液。

1.2.3 体外发酵

准确量取9 mL 由1.2.2 制备得到的肠道菌悬液，加入1 mL EGCG，混合均匀后，37 ℃厌氧培养48 h；EGCG-GIT 也作相同处理，每组样品进行3 次生物学重复实验。空白对照组把EGCG 换成生理盐水，其他条件不变，记作CK。

1.2.4 菌群构成分析

肠道微生物总DNA 提取：采用肠道微生物DNA 试剂盒提取DNA。用1%琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA后进行PCR 扩增[11]。

PCR 扩增：对目标片段16S rDNA V4 区域进行PCR扩增（重复3 次），以第一个引物中的barcode 作为特异引物扩增得到目标产物。将PCR 扩增的产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒切胶回收目标片段，即为PCR 扩增产物[12]。

荧光定量：采用QuantiFluor-ST 蓝色荧光定量系统对PCR 扩增产物进行定量检测，之后按照每个样品的测序量要求，进行相应比例的混合[13]。

文库构建与测序：使用MiSeq 测序仪和MiSeq V3 试剂盒对文库中的片段进行2×300 bp 的双端测序。

1.3 数据分析

采用Illumina MiSeq 平台测序数据分析。高通量测序的原始数据进行质控、过滤、去嵌合体，得到的有效数据，进行分类操作单元的划分以及系统发育学分析，菌群结构差异及差异微生物种类均采用QIIME、Usearch 等软件进行分析[14]。

2 结果与分析

2.1 EGCG 及其体外消化产物对肠道菌群的影响

2.1.1 对肠道菌群α 多样性的影响

肠道菌群α 多样性可用香农指数表示，它包含两个因素：一是种类数目，即丰富度；二是种类中个体分配上的均匀性。种类数目增多可提高α 多样性；同样，种类之间个体分配的均匀性增加也会使α 多样性提高，即α 多样性与香农指数呈正相关[10]。

从EGCG 及其体外消化产物处理的肠道菌群中得到的两组样品，共获得158 775 条16S rDNA 有效序列量，采用Illumina PE250 测序序列对有效序列为97%以上的相似水平进行OTU 生物信息统计分析，足以说明样本所涵盖的肠道菌群类别。由表1 可知，与对照组相比，EGCG组的香农指数无显著变化（P＞0.05），而EGCG-GIT 组的香农指数显著升高（P＜0.05），显著提高肠道菌群的α 多样性，表明消化前后的EGCG 对菌群多样性的影响不同，这可能与消化过程中EGCG 的结构变化有关。

表1 EGCG 和EGCG-GIT 对肠道菌群α 多样性的影响Table 1 Effect of EGCG and EGCG-GIT on α diversity of intestinal flora

2.1.2 主成分分析（PCA）

为了揭示EGCG 组和EGCG-GIT 组之间肠道菌群种类的差异，分析体外模拟消化前后的EGCG 对肠道菌群的总体影响，对样品组进行了主成分分析，见图1。

图1 主成分分析Fig.1 Principal component analysis

由图1 可以看出，第一主成分的贡献率为64.96%，第二主成分的贡献率为23.66%，这两个主成分的累积贡献率为88.62%。这说明由这两个主成分可以解释大部分的变量，PCA 分析能够反映样品的整体信息，且PCA 可以有效区分消化前后的EGCG 组。结果显示，除去EGCG3（可能由于取样问题导致的实验误差），消化前后的EGCG 在PC1 方向表现出了极大的成分差异性，但是在PC2 方向较接近，推测PC1 方向上的差异性是由有益菌丰度变化差异导致的，而PC2 方向上的相似性可能是由相同的有害菌丰度变化导致的。

2.1.3 对肠道微生物类群的影响

图2（见上页）为EGCG 的菌群OTU 聚类分析。结果显示，EGCG 组样品在门和纲水平上的微生物类群数目无明显变化，而在目、科、属水平上的微生物类群变化很大。其中，梭菌属（Clostridium sensu stricto 18）在EGCG 处理过后，数量急剧下降，几乎没有检出。梭菌属是肠道内主要的产丁酸菌，丁酸是一种短链脂肪酸，梭菌属的减少可有效减少这种短链脂肪酸的生成，表明EGCG 可能通过减少梭菌属的含量，从而减少脂质分解成脂肪酸。EGCG 可能通过促进和抑制某些菌属的生长，起到改善肠道免疫功能的作用[15-16]。

图2 EGCG 与CK 在各分类水平的微生物类群对比Fig.2 Comparison of microbial groups of EGCG and CK at various classification levels

由图3 可知，EGCG-GIT 处理的样品整体呈增加趋势，科、属、种水平上的微生物类群变化较大，拟杆菌属明显增加。与图2 相比，消化前后的EGCG 对肠道菌群的影响发生了变化。相比对照组，EGCG 组中，对人体有益的Lactobacillus大幅增加，罗斯拜瑞氏菌属（Roseburia）增加；而能产生芽孢的Clostridium sensu stricto 18明显减少；EGCG-GIT 组中Bacteroides和Anaerotruncus明显增加；对人体有益的Ruminococcaceae小幅增加，而Clostridium sensu stricto18和Lachnoclostridium明显减少。

图3 EGCG-GIT 与CK 在各分类水平的微生物类群对比Fig.3 Comparison of microbial groups of EGCG-GIT and CK at various classification levels

2.1.4 对优势菌属及其相对丰度的影响

EGCG 发酵过程中优势菌属的分析组分图4 和热图6A 显示，肠道菌群前三优势菌属为Escherichia-Shigella、Clostridium sensu stricto 18以及Peptoclostridium。其中，Escherichia-Shigella相比于对照组的相对含量显著增加，Clostridium sensu stricto 18减少到几乎消失，Peptoclostridium显著增加。EGCG-GIT 发酵过程中优势菌属的分析组分图5 以及热图6B 的显示，肠道菌群前三优势菌属为Bacteroides、Clostridium sensu stricto 18、Lachnoclostridium。Bacteroides相比于对照组的相对含量显著增加，Clostridium sensu stricto18减少到几乎没有检出，Lachnoclostridium显著减少。

图4 EGCG 优势物种群落结构分析组分图Fig.4 Composition diagram of community structure analysis of EGCG dominant species

图5 EGCG-GIT 优势物种群落结构分析组分图Fig.5 Composition diagram of community structure analysis of EGCG-GIT dominant species

图6 微生物群落属热图分析Fig.6 Heat map analysis of microbial community

本文肠道微生物的优势菌属与类似报道[17-19]结果相近。拟杆菌属是SD 大鼠体内大量存在的常规菌群，属于革兰氏阴性菌[20]，Cholewisk 等[21]研究发现拟杆菌门的丰度与体脂和体质量呈现负相关，其基因组中富含大量碳水化合物活性酶基因，可以利用多种膳食中的可溶性多糖，代谢产物以乙酸盐和丙酸盐为主。拟杆菌门细菌具有多种产维生素和辅酶的基因，可能在大鼠肠道微生物消化和营养利用中发挥重要作用[22-23]。梭杆菌属是肠道内主要的产丁酸菌，丁酸具有为肠上皮细胞提供能量、促进肠黏膜修复、调节肠道免疫等作用[24-25]。其在EGCG 处理过程中逐渐富集，表明EGCG 可能被梭杆菌属酵解生成短链脂肪酸丁酸，进一步发挥维护肠道健康的作用[26]。

3 结论

消化前后的EGCG 对肠道菌群有不同影响，EGCG并未显著改变肠道菌群的α 多样性，而EGCG-GIT 显著提高了肠道菌群的α 多样性。两者分别处理的肠道菌群都在科、属、种水平丰度呈现显著差异。尽管消化前后的EGCG 均能显著降低有害菌梭菌属（Clostridium sensu stricto 18）的丰度，但两者对有益菌的影响存在差异，EGCG 可显著提高有益菌乳杆菌属（Lactobacillus）和罗斯拜瑞氏菌属（Roseburia）的丰度；其消化产物则是使有益菌瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）小幅增加。消化前后的EGCG 对大鼠肠道菌群组成的影响情况不同，可能与其消化过程中的结构变化有关，未来可进一步研究EGCG在消化过程中的组成变化及其影响因素，探讨提高EGCG 生物利用率运载体系的制备工艺。