结直肠癌组织中血浆激肽释放酶B1 蛋白的表达变化及其临床意义

周凡，齐月雯，时军利，王磊，何培元，陈健，王渝，李炳庆

承德医学院附属医院消化内科，河北承德067000

结直肠癌是全球常见的恶性肿瘤之一，据2020年美国癌症学会发布的全球癌症统计数据显示，其发病率居恶性肿瘤第3 位，死亡率高居第2 位，已严重威胁人类的健康［1］。尽管目前可以通过手术及放化疗等方式得以改善，但由于其早期症状隐匿，且临床尚无诊断和预后的特异性指标，多数患者发现时已属于中晚期，错失了最佳治疗机会［2-4］。因此，寻找特异性诊断、预测和靶向治疗标志物成为结直肠癌研究的关键问题。血浆激肽释放酶B1（Plasma Kallikrein B1，KLKB1）是一种丝氨酸蛋白酶，广泛存在于多种组织和血液中，参与内源性凝血级联反应、炎症反应、纤溶系统、肾素—血管紧张素系统等多种生理病理过程［5-7］。近年研究［8-9］证实，KLKB1在肺和胸膜肿瘤、肝癌组织中表达降低，具有抑制肿瘤的生长和增殖的作用。目前关于KLKB1 在结直肠癌的相关基因表达谱研究显示与癌旁配对组织相比，KLKB1 基因在结直肠癌中呈现特异性低表达［10-12］，可发挥抑制结直肠癌作用。 目前国内外关于KLKB1 在结直肠癌方面鲜有报道，尚无涉及组织水平相关验证。本研究应用免疫组织化学染色法观察了结直肠癌及其配对癌旁组织中KLKB1 蛋白的表达变化，并分析其表达与临床病理参数的相关性，为结直肠癌的病情评估及治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1. 1 临床资料 选取2019 年10 月—2020 年10 月在承德医学院附属医院胃肠外科住院的结直肠癌患者86 例，男53 例、女33 例，年龄40～84（63. 57 ±10. 34）岁，其中年龄＜60 岁者34 例、≥60 岁者52 例，肿瘤直径≥5 cm 者19 例、＜5 cm 者67 例，结肠癌40例、直肠癌46例，无淋巴结转移者42例、有淋巴结转移者44例，浸润深度T1～T3者36例、T4者50例，临床分期为Ⅰ+ Ⅱ期42 例、Ⅲ+ Ⅳ期44 例。所有患者均接受根治性手术治疗，术中留取结直肠癌组织及癌旁正常组织（距癌组织3 cm），留取的组织标本经固定、脱水、透明、浸蜡和包埋，制作成蜡块常温保存。纳入标准：①术后病理结果明确诊断为结直肠癌；②肿瘤患者均为初发，未接受放疗和化疗等相关治疗；③接受根治性手术治疗；④临床病理资料完整。排除标准：①具有遗传性肠道疾病家族史；②合并其他部位肿瘤；③严重心、肝、肾等脏器疾病。本研究经承德医学院附属医院医学伦理委员会批准，患者或其家属签属知情同意书。

1. 2 结直肠癌组织及癌旁正常组织中KLKB1 蛋白检测方法 采用免疫组织化学法。取结直肠癌组织及癌旁正常组织标本，切片后经过二甲苯脱蜡、梯度乙醇水化，PBS冲洗后置入柠檬酸钠缓冲溶液中，微波加热抗原修复。取出后冷却至室温，滴加3% 过氧化氢消除内源性过氧化物酶活性，正常山羊血清封闭液封闭，滴加KLKB1 一抗后4 ℃孵育过夜。次日，加入SP试剂、DAB显色液，显微镜下观察染色程度，流水冲洗终止反应，随后苏木精复染、盐酸酒精分化、氨水返蓝，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固，采用半定量积分法在显微镜下观察KLKB1蛋白表达情况。具体方法如下：①阳性细胞百分比：＜5% 记0 分，5%～25% 记1 分，26%～50% 记2分，51%～75% 记3 分，76%～100% 记4 分；②染色强度：无色记0 分，淡黄色记1 分，黄色记2 分，棕黄色记3 分，①、②两项评分的乘积为最终评分，0～1分阴性表达，1分及以上为阳性表达［13］。

1. 3 统计学方法 采用SPSS26. 0 统计软件。计数资料比较用χ2检验，相关性分析用Spearman 秩相关分析法。P＜0. 05为差异有统计学意义。

2 结果

2. 1 结直肠癌组织及癌旁正常组织中KLKB1 蛋白阳性表达率比较 结直肠癌组织及癌旁正常组织中KLKB1蛋白阳性表达率分别为45. 3%、72. 1%，两者相比，P＜0. 05。

2. 2 KLKB1 蛋白阳性表达与结直肠癌患者临床病理参数的关系 KLKB1 蛋白阳性表达与结直肠癌患者临床病理参数的关系见表1。由表1 可知，KLKB1 蛋白阳性表达与结直肠癌患者肿瘤直径、淋巴结转移、临床分期有关（P均＜0. 05），与性别、年龄和浸润深度无关（P均＞0. 05）。

表1 KLKB1蛋白阳性表达与结直肠癌患者临床病理参数的关系

2. 3 KLKB1 蛋白阳性表达与结直肠癌患者临床病理参数的相关性 KLKB1 蛋白阳性表达与结直肠癌患者肿瘤直径、淋巴结转移、临床分期呈负相关关系（r分别为-0. 260、-0. 231、-0. 231，P均＜0. 05）。

3 讨论

结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，2020年我国新发结直肠癌患者约55万，居第2位，死亡患者约29万，居第5位［14］，严重威胁人们的健康。目前临床缺少结直肠癌早期诊断和预后的特异性指标，多数患者可能错失最佳治疗机会，结直肠癌相关肿瘤分子标记物的研究越来越被国内外专业领域学者和医生重视［15］。

KLKB1 是一种丝氨酸蛋白酶，广泛分布于血液和多种组织中，参与凝血系统、纤溶系统、炎症反应等多种生理病理过程［5-6，16-17］。KLKB1 在多种肿瘤中存在表达差异，越来越多的研究发现其有望成为肿瘤诊疗的新靶点。WONG 等［8］研究发现，经去甲基干预的肺癌及间皮瘤细胞中KLKB1 表达明显增加。KLKB1 可通过激活激肽B1 和B2 受体发出信号，干预新血管的形成，从而抑制肺和胸膜肿瘤的生长和增殖，提示KLKB1 可作为一种抑癌基因调节肿瘤的发生发展［18］。

本研究收集临床患者结直肠癌组织和其配对的癌旁组织，通过免疫组织化学方法从组织水平检测KLKB1蛋白的表达情况，结果显示KLKB1蛋白在结直肠癌组织中的表达明显低于配对的癌旁组织，其表达的降低提示在结直肠癌中KLKB1 蛋白可能发挥抑癌作用，这与LI等［9］研究相符。此外，CHE等［19］研究发现，肝癌患者外周血中KLKB1 蛋白表达显著降低，且与预后存在明显相关性。

本研究收集结直肠癌患者的临床病理资料，分析KLKB1 与患者临床病理参数的关系，结果发现KLKB1 蛋白在结直肠癌中的阳性表达与患者肿瘤大小、淋巴结转移及临床分期呈负相关。CHE 等［19］研究发现，KLKB1 的表达与肿瘤分期、肿瘤分级、肝组织炎症和Ishak纤维化评分相关，这与本次研究结果一致。已有研究［12］发现，KNG1 作为结直肠癌组织中下调的关键核心基因，在补体和凝血级联中，可直接被KLKB1调控。KNG1可作为一个潜在的预后靶点，在结直肠癌及肝癌组织中呈特异性低表达，可调控凝血过程，促进转移的发生。以上研究均提示我们，KLKB1 可能通过调控KNG1 的表达进而抑制结直肠癌的发生发展，其低表达导致结直肠癌患者临床分期的恶化，可作为结直肠癌患者预后不良的重要信号，有望为临床控制结直肠癌进展和转移提供新的靶点。

综上所述，结直肠癌组织中KLKB1 蛋白呈低表达，且其表达与肿瘤直径、淋巴结转移、临床分期之间呈负相关，可能参与了结直肠癌的发生发展，有望成为结直肠癌的诊疗和预后评估提供新的理想靶点。KLKB1在结直肠癌中是否可通过调节KNG1发挥抑癌作用，其中具体的作用机制如何值得我们在后续试验中进一步验证。