山丹种子表面灭菌方法比较试验

邓 煜，王 蒙，李发虎，李龙梅，侯 佳

（1.内蒙古农业大学园艺与植物保护学院，内蒙古呼和浩特 010011；2.内蒙古农业大学职业技术学院，内蒙古萨拉齐 014109）

山丹（Lilium pumilum）是百合科（Liliaceae）百合属（Lilium）卷瓣组多年生草本植物。野生山丹种质资源在我国非常丰富，分布范围包括北京、黑龙江、青海、吉林、辽宁、宁夏、内蒙古、山东、山西等地[1]。相对于其他百合科花卉，山丹的优点较为突出：环境适应能力强、抗性强、花期早、花期长，可以在我国北方地区花坛、花境等园林造景中作为主要的填充植物。此外，山丹还可以作为百合属花卉抗性育种和品质改良的重要基因资源[2-4]；还是药食两用的植物，含有甾体皂苷、磷脂、硝酸甘油酯、生物碱、多糖等多种活性成分，在临床有抗癌、抗炎、抗氧化、抗抑郁等作用[5]。随着山丹潜在市场的不断挖掘，人们开始认识到其产业发展规模和应用潜力，在高效再生体系创建方面开展了大量工作，为其开展规模化生产奠定了基础。

已有研究表明，百合属植物再生能力较强，适合开展组织培养。利用组织培养技术不仅可以提高山丹繁殖效率，还可以改善推广工作中多代无性繁殖造成的品质退化和病毒积累等问题。目前，山丹的离体快繁再生体系已经初步建立，并对山丹组培苗的继代培养、生根培养及移栽条件进行了研究[6-9]。但在实践操作中，相对于其他百合属植物，山丹组织培养技术中存在的问题主要有分化缓慢、生长缓慢和愈伤组织诱导率低等。山丹的结实率较高，但自然条件下存在种子发芽率低、发育不整齐等问题[10]。通过无菌组织培养种子繁殖技术播种（以下简称无菌播种）可以有效解决上述问题，并提高山丹繁殖效率。无菌播种最早在种子繁殖较困难的兰科植物中广泛开展[11-12]，近年来百合属植物中也有报道[13]。无菌播种能在短时间内快速获得大批量的植物材料，是推广工厂化生产的有效繁殖手段[14-16]。外植体的表面消毒方法决定其污染率和萌发率及后续生长状况，是开展无菌播种的重要技术瓶颈，但在山丹无菌播种中，这方面尚不多见。本试验以山丹种子为材料，比较表面灭菌剂种类、消毒时间等因素对山丹无菌播种的影响，旨在为山丹工厂化育苗及育种找出无菌播种最佳表面灭菌方法，从而扩大野生山丹种质资源利用范围、加快山丹工厂化育苗进程。

1 材料和方法

1.1 试验材料

本试验于2020年3—5月在内蒙古农业大学职业技术学院科技园区组织培养繁育中心开展。试验材料是从内蒙古农业大学科技园区种质圃内采集的3年生山丹种子。先将山丹种子低温（4 ℃）、黑暗储存。挑选饱满、种子内胚清晰（胚长为1/2 种长）的种子作为试验材料（图1）。

图1 山丹种子

1.2 试验方法

1.2.1 预处理

参照巨球百合[13]种子无菌播种的方法并略做改进，首先去除干瘪的种子，将种子浸泡于添加1～2 滴洗洁精的水溶液中30 min，流水下连续冲洗2～4 h。轻轻对种子表面进行清洗，吸干种子表面水分。

1.2.2 灭菌处理

在无菌工作环境下，75%乙醇快速消毒30 s，无菌水冲洗振荡3 次，分别以0.1%升汞和1.0%NaClO 振荡处理，灭菌设置时间为0、5、10、15、20、25、30 min，再用无菌水冲洗振荡3 次，最后用灭菌滤纸吸干种子表面水分，将种子接种到MS 培养基上。采用单因素完全随机设计，每个处理重复3 次，每瓶接种5 枚种子，每个重复接种3 瓶。

1.2.3 培养条件

培养基为MS 培养基，添加6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。无菌培养室条件为光照强度2 500 lx、光照15 h/d、温度（25±2）℃。定期观察发芽情况及生长发育情况，发芽标志是以胚根露出种皮1～2 mm为准。

1.2.4 数据记录与统计分析

种子接种于培养基后，每天定时观察、记录污染情况和种子开始萌发的时间。每隔3 d 观察1 次，记录萌芽情况。培养10 d 后统计各处理无菌苗的污染率，根据萌发情况统计萌发率。接种48 d 时统计诱导率、诱导芽数，记录胚芽、胚根数量，并用螺旋测微尺测量胚芽、胚根长度。之后将山丹幼体继代培养，每瓶5 粒。数据采用Microsoft Excel 2007软件进行整理并制图，SPSS 21.0 统计软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同灭菌处理对山丹种子污染率的影响

随着消毒剂处理时间的梯度增加，0.1%升汞和1.0%NaClO 两种消毒剂处理后种子的污染率呈现明显降低趋势（表1）。0 min 和5 min 污染严重，污染率为100%。处理时间10 min，污染率明显改善，0.1%升汞处理污染率为62.22%，1.0%NaClO 处理污染率为65.19%。处理15 min 后，污染率稳定在10%以下。两种消毒剂均在处理20 min 时，污染率达到最低。相同处理时间下，0.1%升汞处理污染率均低于1.0%NaClO 处理。

2.2 不同灭菌处理对山丹种子发芽情况的影响

2.2.1 0.1%升汞处理对山丹种子发芽情况的影响

经0.1%升汞处理后，山丹种子开始萌发时间为7～15 d，随着处理时间的延长种子开始萌发的时间明显推迟，20、25、30 min 处理下，萌发时间分别为11.67、13.33、14.67 d（表2），高于10、15 min 的8.00 d。0.1%升汞处理时间越长，山丹种子的完全萌发时间越长，10、15 min 这两个处理的完全萌发时间分别为13.67、15.67 d，优于其他几个处理；而30 min 处理的完全萌发时间需要22.33 d；而0、5 min 处理时间短，污染率达100%，未记录萌发数据。萌发率结果与萌发时间趋势相同，10、15 min 的萌发率较高，分别为95.56%和97.78%，显著高于其他处理（P＜0.05）；随着0.1%升汞处理时间的延长，萌发率呈下降趋势，而处理10、15、20、25 min 诱导率无显著差异（P＞0.05），但与处理30 min 相比差异显著（P＜0.05）。经0.1%升汞不同处理时间的山丹种子，胚芽数、胚芽长度、胚根数和胚根长度随着处理时间的延长呈现先升高后降低趋势，15 min 处理山丹种子的生长情况优于其他处理（表3）。

表3 0.1%升汞不同灭菌时间对山丹种子生长的影响

2.2.2 1.0%NaClO 处理对山丹种子发芽情况的影响

由表4 可知，经1.0%NaClO 不同处理时间的山丹种子，开始萌发时间为8～20 d，晚于相同时间0.1%升汞处理。20、25、30 min 处理的萌发时间分别为9.67、11.67、15.00 d，分别高于10、15 min 处理的8.67、9.33 d。随着1.0%NaClO 处理时间的延长，完全萌发时间表现出逐渐增加的趋势，10、15 min 两个处理完全萌发时间最短，均为15.67 d；30 min 处理的完全萌发时间最长，为23.33 d（0、5 min 由于污染率100%，未记录数据）。萌发率也表现出与萌发时间一致的趋势，0、5 min 因污染率达100%，污染严重未记录数据；后续10、15 min 的萌发率较高，分别为94.81%和95.56%，与其他处理相比存在显著差异（P＜0.05）；之后随着1.0%NaClO 处理时间的延长，萌发率呈明显下降趋势。

表4 1.0%NaClO 不同灭菌时间对山丹种子萌发的影响

由表5 可知，经1.0%NaClO 不同处理时间的山丹种子胚芽数、胚芽长度、胚根数和胚根长度（0、5 min因污染材料死亡未获得数据；30 min 因死亡或胚芽过短未获得数据），随着处理时间的延长呈现先升高后降低的趋势，15 min 处理山丹种子生长情况均优于其他处理。

表5 1.0%NaClO 不同灭菌时间对山丹种子生长的影响

3 讨论与结论

山丹作为百合科重要的乡土花卉资源，具有良好的生态适应性，观赏性状突出、特性明显，同时还具有丰富的药用和营养价值，市场认可度逐年上升。但是随着其生产规模的不断扩大，也与其他百合资源生产一样需要通过工厂化育苗提高生产效率和降低病害发生率。山丹种球小、鳞茎片数少，开展无性繁殖效率低下。山丹种子发芽虽然繁殖率和发芽率高，但存在发芽率受环境影响大、发芽持续时间长（达40 d）、生长情况参差不齐、不符合规模化生产要求等问题。通过建立高效再生体系，利用组织培养技术进行大规模生产，还存在分化缓慢、增殖率低等技术瓶颈，不利于这项技术的快速推广。综合上述方法的优缺点，采用无菌播种进行快速繁殖，其发芽率高、发芽持续时间短，生长均匀，可以作为开展山丹工厂化生产的有效切入点。污染是无菌播种过程中的重要问题，也是决定无菌播种成败的关键。山丹种子常携带大量微生物且难以清除，故无菌播种中种子的生理状态、灭菌剂种类、灭菌时间及灭菌方法等都是需要解决的问题[13-14]。

本试验结果表明，0.1%升汞处理下，山丹的发芽情况和生长情况优于1.0%NaClO 处理。随着处理时间的延长，种子萌发和生长情况呈现先增加后减少的趋势，0.1%升汞和1.0%NaClO 处理，0、5 min 处理虽然萌发较快，但污染率高达100%；两种消毒剂10、15、20、25 min 处理均表现为先升高后降低的趋势，15 min 灭菌处理下山丹的萌发情况和生长情况均优于其他处理。

外植体消毒是外植体培养的关键环节之一，消毒试剂的选择和消毒时间的确定是核心。不同种类的消毒剂在消杀细菌的同时会破坏植物细胞，细胞通过产生大量次生代谢物质启动自我保护[17]。消毒时间太短，外植体消毒不彻底，污染严重，本试验中两种消毒剂0、5 min 处理下，污染率均高达100%。若消毒时间过长，细胞会被毒害，导致外植体褐变甚至死亡，本试验中两种消毒剂30 min 处理下，萌发率最低，且后期生长情况很差。因此，通过本试验可以初步确定适合山丹种子无菌播种发芽及生长情况的消毒剂和消毒时间。

综上所述，山丹种子无菌播种较传统繁殖方法效率高、出芽整齐，便于规模化推广。结合山丹种子消毒方法，可在温度（25±2）℃、光照（光照度为2 500 lx）、培养基（MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L）等培养条件一致的情况下，采用75%乙醇消毒30 s配合0.1%升汞连续处理15 min，山丹种子能够取得较高的萌发率和较好的幼苗生长质量。