氟苯尼考中间体氟代物含量的检测方法

王新江(浙江康牧药业有限公司，浙江 嵊州 312400)

0 引言

氟苯尼考(Florfenicol)学名为氟甲砜霉素，属于当前一种较为新型的酰胺醇类抗生素。该药物由美国公司先灵-葆雅公司在1988年研制成功，是一种兽医专用的氯霉素类光谱抗菌类药物[1]。该药物虽然由美国公司研发，但是首次是在日本上市，随后在挪威上市，药品名称为Aquatlor。在1955年，法国引进该药物并将其命名为Nuflor。而我国引进相对较晚，在1999年才正式批准该药物为国家二类新兽药。目前，氟苯尼考已经在兽医临床方面应用较多，主要用于防治细菌类疾病，例如治疗牛呼吸道方面由巴氏杆菌引起的感染、乳腺炎等，家禽类的大肠杆菌和禽霍乱等病症。但是近年来，随着世界上禽畜养殖业的高速发展，禽畜业临床方面的细菌感染也随之出现较大的变化，朝着混合及复杂性方向发展。为更好的应对上述变化，近年来相继有大量耐氟苯尼考菌株的出现，同时一些氟苯尼考药物的不规范使用使得药物出现较大的毒性[2]。因此有必要研究一些新型的制剂技术，改善当前氟苯尼考药物性能。

综合近些年的相关研究可知，国内外都开展关于氟苯尼考及其代谢产物的检测，尤其是在中间体氟代物的检测取得一定的成果。为更好的应用氟苯尼考，有必要研究其生产过程中相关问题，从而提高疗效与生物利用度。

1 理化性质

氟苯尼考的结构式具体如图1所示，其化学名为D(+)-苏-1-对甲砜基苯基-2-二氯乙酰胺-3-氟丙醇，分子式为C12H14Cl2FNO4S，分子量为358.22。氟苯尼考作为一种氟化衍生物，类似于氯霉素，二者同样不具有硝基，所以同样具有不会引起畜禽类的再生障碍性贫血[3]。氟苯尼考为白色或者类白色的结晶性粉末，无臭，极其容易溶解于二甲基酰胺，能够较好溶解在甲醇，冰醋酸中微融，在水或者氯仿中极微融。

图1 氟苯尼考结构图

2 抗菌机理

氟苯尼考在发挥抗菌作用时，其主要机理变现在同70S核蛋白体的50S亚基为目标靶点，同该靶点位置的A位实现紧密结合，从而有效阻碍了肽酰基转移酶的转肽反应，阻止其肽链的延伸，从而抑制细菌蛋白质合成，实现抗菌效果。细菌在进化过程中，已经逐步对氯霉类药物出现了耐药性，上述特征的出现主要是和细菌的耐药基因有关[4]。早在1996年就已经实现了对氟苯尼考耐药基因pp-FloR的分离鉴定，随后在2000年和2002年先后发现了大肠杆菌的氟苯尼考耐药基因。从上述发现成果中，可以看出主要是由于病原细菌产生了氯霉素乙酰转移酶，也就是氯霉素和甲砜霉素最为容易诱发上述情况的出现。

氟苯尼考作为动物专用的抗菌素药物，在禽畜业应用广泛，因此当前对于应用方式和应用效果研究较多，但是关于氟苯尼考的原料生产和制剂生产研究相对较少，尤其是关于如何有效控制杂质残留方面更是鲜见。对于氟苯尼考生产过程中，原料中及其容易存在一些杂质，对于不同企业而言，由于其工艺和技术的不同，因此在生产氟苯尼考的原料质量方面，也都是略有差异。对于氟苯尼考原料生产，其杂质主要包含D-乙酸，甲砜氨，D-乙酯等其他的一些氟代物中间体[5]。这些杂质的存在，降低了氟苯尼考在应用的有效性，主要是降低了在水溶液中的溶解性，即使在后期采用一定的技术手段提高药物的溶解性，但是同时也提高了杂质的溶解性，对于氟苯尼考的最大溶解度而言依旧起不了多大作用。因此在实际应用中，即使加倍或者加数倍使用药物，由于畜禽饮水的水线末端药物浓度几乎保持不变，因此在临床方面不会出现药效提升的迹象。在上述杂质中，尤其是中间体氟代物，对于氟苯尼考的质量影响最为明显，因此有必要对氟苯尼考的生产进行中间体氟代物的检测，从而衡量当前氟苯尼考生产质量的合理有效性。

3 关于氟苯尼考中间体氟代物的含量检测

目前在国内，关于开展氟苯尼考制剂检测的方法主要有电位滴定法，紫外分光光度法和旋光法，高效液相、气相色谱法等[6]。当前企业在开展氟代物含量的检测中，最为常用的方式就是采用气相色谱法，该方法将氟代物用乙醇溶解后，直接将溶液进入气相色仪中，检测氟代物的含量，乙醇溶剂影响氟代物含量计算，该方法误差比较大，准确度较差，检测时间偏长，对生产的指导意义不理想。因此本文将采用液相方法进行研究，以便快速准确检测氟代物含量。氟苯尼考的合成一般以D-对甲砜基苯丝氨酸乙酯为起始原料，经硼氢化钾还原反应，然后与二氯乙腈发生环合反应得到环合物，环合物再与氟化剂(试剂，FPA)发生氟化反应，得到中间体氟代物，然后再经水解脱色、结晶、离心、干燥、粉碎、混合、包装得到氟苯尼考产品。氟代物的分子式为C12H12Cl2FNO3S，分子量为340，氟代物的主要成分含量直接影响到后续生产氟苯尼考的含量与杂质残留。因此，精确及时检验氟代物含量既能可以指导企业生产，又可以提升企业氟苯尼考产品质量。

4 实验部分

4.1 主要仪器

Agilent 1260液相色谱，赛默飞U3000液相色谱仪；C18色谱柱；天子天平；50mL容量瓶。

4.2 主要试剂

色谱乙腈；色谱甲醇；纯化水；色谱级三氟乙酸。

4.3 实验方法

4.3.1 色谱条件

色谱柱：SB-C18 150 nm×5 μm×4.6 μm；波长：223 nm；检测器：UV检测器。

流动相A：乙腈；流动相B: 0.075%三氟乙酸水溶液。

流速为 1.0 mL/min；柱温：25 ℃；进样量 5 μL。

流动相B配制：取纯净水1 000 mL，加三氟乙酸0.75 mL，混匀，用0.45 μm的水系滤膜抽滤。

流动相梯度分析如表1所示。

表1 方法流动相梯度

4.3.2 实验方法

称取氟代物25 mg(精确于0.000 1 g)，置于50 mL容量瓶中，加色谱甲醇溶解并定容至量瓶刻度，摇匀后滤过，取5 μL滤液进入液相色谱仪中，记录色谱峰，按面积归一法进行定量计算氟代物含量。

5 结果与讨论

5.1 检测波长的选择

氟代物用甲醇溶解后，通过紫外波长扫描，发现氟代物在223 nm处有较大紫外吸收，为此方法确定检测波长为223 nm，如图2 所示。

图2 氟代物光谱扫描曲线图

5.2 流动相的选择

分别使用不同比例的甲醇、乙腈、水作为流动相，对试样进行分离、色谱峰形条件的选择，结果表明，用乙腈与0.075%三氟乙酸水溶液为流动相，并进行梯度分析，分离度效果较好，满足检测分析要求，且检测成本低，检测时间短。典型色谱图如图3所示。

图3 氟代物典型色谱图

5.3 方法精密度试验

准确称取同一样品的6个平行样，在上述色谱条件下进行平测定，计算其标准偏差和RSD，6次平行测定结果如表2所示。

表2 不同氟代物样品平测定结果

5.4 专属性和准确度测试结果

精密称取氟代物5份，每份中加一定量的中间体环合物，在相同的色谱条件下测定，氟代物与环合物的分离度符合要求，环合物的存在不影响氟代物含量检测，结果如表3和图4所示。

图4 氟代物样品测试数据曲线

表3 氟代物样品测试结果表

6 结语

试验结果表明，用本方法测定氟苯尼考中间体氟代物含量具有较高的精密度和准确性，环合物与氟代物有良好的分离度，该方法操作简单、快速，是一种较为理想的快速分析方法，便于生产质量控制。