毛秀才INW-Ⅰ对MC3T3-E1细胞增殖和分化的影响及分子机制研究

李 兴，吴陈朋，刘 玉，曾宪灵，陈端忠，彭小珍★

（1. 湖南医药学院公共卫生与检验医学院，湖南 怀化 418000 ；2. 湖南医药学院医学院，湖南 怀化 418000）

毛秀才又名显脉旋覆花Inula nervosa Wall.，为菊科旋覆花属植物，主要产于我国四川西部、云南北部至南部、贵州西部、广西西部及湖南怀化地区[1-2]。侗药记载，毛秀才具有祛风寒、通经络、消积止痛等功效，尤其在治疗跌打损伤、骨折方面有很好的疗效，且其无毒副作用[3]。但目前关于毛秀才治疗骨折作用机制及分子机制的研究较少。本研究以小鼠颅顶前成骨细胞亚克隆14（MC3T3-E1 subclone 14）为细胞模型，检测毛秀才二氯甲烷部位（INW- Ⅰ）对MC3T3-E1 细胞活性的影响，同时验证毛秀才INW- Ⅰ对该细胞细胞外信号调节激酶（ERK1/2）和骨形态发生蛋白9（BMP-9）mRNA 及蛋白表达的影响，为毛秀才的临床应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

毛秀才（ 采集于湖南怀化雪峰山）；MC3T3-E1 细胞（ 购于中国科学院上海细胞库）；胎牛血清（FBS）（购于美国HyClone 公司）；高糖DMEM 培养基（购于美国Gibco 公司）；CCK-8 试剂盒（购于中国Procell 公司）；ERKI/2、BMP-9 抗体和二抗（购于英国Abcam公司）。

1.2 方法

1.2.1 毛秀才INW- Ⅰ的提取 用95% 的乙醇提取获得毛秀才总浸膏，依次用石油醚、二氯甲烷、正丁醇、乙酸乙酯对毛秀才总浸膏进行萃取，分别获得毛秀才石油醚部位、INW- Ⅰ、正丁醇部位、乙酸乙酯部位和水部位。将毛秀才INW- Ⅰ冻干后获得INW- Ⅰ粉末，置于-20℃的冰箱中保存备用。

1.2.2 MC3T3-E1 细胞的培养 培养基为10% 的FBS+ 高糖DMEM 培养基，培养环境为37℃、5%的CO2培养箱。

1.2.3 MC3T3-E1 细胞活性的检测 采用CCK-8试剂盒检测MC3T3-E1 细胞的活性，将细胞接种于96 孔板内（5000 个细胞/ 孔），建立对照组和INW- Ⅰ药物组。INW- Ⅰ药物浓度为：100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL、400 μg/mL、500 μg/mL、600 μg/mL。孵育24 h 后，每孔加入10 μL 的CCK-8 试剂，1 h 后用酶标仪检测（检测波长为450 nm）其光密度（OD）值，并检测每组细胞的相对活性。根据检测结果，确定500 μg/mL 为最佳浓度。将MC3T3-E1 细胞分为对照组、500 μg/mL INW- Ⅰ组、ERK1/2 抑制剂U0126 组和BMP-9 抑制剂Noggin 组。检测各组MC3T3-E1 细胞的活性，具体的检测方法同上。

1.2.4 MC3T3-E1 细胞mRNA 表达水平的检测提取MC3T3-E1 细胞的RNA，操作步骤是：吸走培养基，用预冷的PBS 清洗2 次，在对照组、500 μg/mL INW- Ⅰ组、ERK1/2 抑制剂U0126组、BMP-9 抑制剂Noggin 组MC3T3-E1 细胞培养皿中分别加入1 mL 的Trizol，静置10 min 后加入200 μL 的氯仿，上下颠倒后静置5 min。以12 000 rpm 的转速进行15 min 的离心处理，取上清液。将上清液滴入另一支新的EP 管中，加入200 μL 的异丙醇，静置10 min 后以12 000 rpm的转速进行15 min 的离心处理。弃去上清液，加入75% 的乙醇，以12 000 rpm 的转速进行10 min的离心处理。弃去上清液，用滤纸吸走杯壁上的液体，加入20 μL 的焦碳酸二乙酯（DEPC）水溶解，测定RNA 的浓度。逆转录：具体的操作方法参照试剂盒的说明书。聚合酶链式反应（PCR）：反应所需的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，具体的引物序列见表1。反应体系及操作步骤参照试剂盒的说明书。

表1 引物序列

1.2.5 MC3T3-E1 细胞中p-ERK1/2、BMP-9 蛋白表达水平的检测 将对照组、500 μg/mL INW- Ⅰ组、ERK1/2 抑制剂U0126 组、BMP-9 抑制剂Noggin 组MC3T3-E1 细胞经RIPA 裂解液裂解后，以12 000 rpm 的转速在4 ℃下进行30 min 的离心处理，取上清液，采用蛋白质定量（BCA）法测定上清液中p-ERK1/2、BMP-9 蛋白的浓度。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）法分离上清液中的p-ERK1/2、BMP-9 蛋白，分别孵育一 抗p-ERK1/2（1:1000）、BMP-9（1:1000）、Tubulin（1:1000）和二抗。

1.3 观察指标

观察不同浓度的毛秀才INW- Ⅰ对MC3T3-E1 细胞活性的影响。观察毛秀才INW-Ⅰ、ERK1/2 抑制剂U0126 和BMP-9 抑制剂Noggin 对MC3T3-E1 细胞活性的影响。观察对照组、500 μg/mL INW- Ⅰ组、ERK1/2 抑制剂U0126 组、BMP-9 抑制剂Noggin 组MC3T3-E1细胞中ERK1/2、BMP-9 mRNA 及p-ERK1/2、BMP-9 蛋白的表达情况。

1.4 统计学方法

用SPSS 17.0 软件处理本研究中的数据，计量资料用±s表示，组间比较用t检验或单因素方差分析，P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度的毛秀才INW-Ⅰ对MC3T3-E1细胞活性的影响

各组（对照组和不同浓度的INW- Ⅰ组）MC3T3-E1 细胞在培养24 h 后，采用CCK-8 试剂盒检测其OD 值，结果显示，不同浓度INW- Ⅰ组MC3T3-E1 细胞的OD 值均高于对照组MC3T3-E1 细胞，差异有统计学意义（P＜0.05）。在浓度为100 ～500 μg/mL 的范围内，毛秀才INW- Ⅰ的浓度越高MC3T3-E1 细胞的OD 值越大，组间相比差异有统计学意义（P＜0.05）。详见图1。这说明，浓度为100 ～600 μg/mL 的毛秀才INW- Ⅰ均能提高MC3T3-E1 细胞的活性，促进其增殖，且500 μg/mL 这一浓度是促进MC3T3-E1 细胞增殖最适宜的浓度。

图1 不同浓度毛秀才INW-Ⅰ对MC3T3-E1 细胞活性的影响

2.2 500μg/mLINW-Ⅰ、U0126 及Noggin对MC3T3-E1 细胞活性的影响

各组（ 对照组、500 μg/mL INW- Ⅰ组、ERK1/2 抑制剂U0126 组、BMP-9 抑制剂Noggin组）MC3T3-E1 细胞在培养24 h 后，采用CCK-8试剂盒检测其OD 值，结果显示，500 μg/mL INW- Ⅰ组MC3T3-E1 细胞的活性显著高于对照组，ERK1/2 抑制剂U0126 组、BMP-9 抑制剂Noggin 组MC3T3-E1 细胞的活性均低于对照组， 其中BMP-9 抑制剂Noggin 组MC3T3-E1细胞的活性最低，组间相比差异有统计学意义（P＜0.05）。详见图2。这说明，500 μg/mL 的毛秀才INW- Ⅰ可显著提高MC3T3-E1 细胞的活性，BMP-9 抑制剂Noggin 和ERK1/2 抑制剂U0126 均可抑制MC3T3-E1 细胞的活性，且BMP-9 抑制剂Noggin 对MC3T3-E1 细胞活性的抑制效果最强。

图2 500 μg/mL INW-Ⅰ、U0126 及Noggin 对MC3T3-E1 细胞活性的影响

2.3 各组MC3T3-E1 细胞中ERK1/2 和BMP-9mRNA 的表达

各组（ 对照组、500 μg/mL INW- Ⅰ组、ERK1/2 抑制剂U0126 组、BMP-9 抑制剂Noggin组）MC3T3-E1 细胞在培养24 h 后，分别观察其ERK1/2 和BMP-9 mRNA 的表达水平， 结果显示，500 μg/mL INW- Ⅰ组MC3T3-E1 细胞中ERK1/2 mRNA 的表达水平高于对照组，ERK1/2 抑制剂U0126 组MC3T3-E1 细胞中ERK1/2 mRNA 的表达水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。详见图3A；500 μg/mL INW- Ⅰ组MC3T3-E1 细胞中BMP-9 mRNA 的表达水平高于对照组，BMP-9 抑制剂Noggin 组MC3T3-E1 细胞中BMP-9 mRNA 的表达水平低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。详见图3B。这说明，500 μg/mL 的毛秀才INW- Ⅰ对MC3T3-E1 细胞中ERK1/2 和BMP-9 mRNA 的表达均有显著的促进作用，ERK1/2 抑制剂U0126对MC3T3-E1 细胞中ERK1/2 mRNA 的表达具有显著的抑制作用，BMP-9 抑制剂Noggin 对MC3T3-E1 细胞中BMP-9 mRNA 的表达具有显著的抑制作用。

图3 500 μg/mL INW-Ⅰ、U0126 及Noggin 对MC3T3-E1 细胞中ERK1/2、BMP-9 mRNA 表达的影响

2.4 各组MC3T3-E1 细胞中p-ERK1/2 和BMP-9 蛋白的表达

各 组（ 对 照 组、500 μg/mL INW- Ⅰ组、ERK1/2 抑制剂U0126 组、BMP-9 抑制剂Noggin 组）MC3T3-E1 细胞在培养24 h 后，对其p-ERK1/2 和BMP-9 蛋白的表达水平进行检测，结果显示，500 μg/mL 的毛秀才INW- Ⅰ可促进MC3T3-E1 细胞中p-ERK1/2 和BMP-9 蛋白的表达，而ERK1/2 抑制剂U0126 可抑制MC3T3-E1细胞中p-ERK1/2 蛋白的表达，BMP-9 抑制剂Noggin 可抑制MC3T3-E1 细胞中BMP-9 蛋白的表达。详见图4A、4B。

图4 500 μg/mL INW-Ⅰ、U0126、Noggin 对MC3T3-E1 细胞中p-ERK1/2和BMP-9 蛋白表达的影响

3 讨论

骨折的愈合是一个极其复杂的组织学、生物学、内分泌学、生物力学修复的过程。受诸多因素的影响，骨折患者可发生骨折延迟愈合或不愈合[4]。据不完全统计，有5% ～10% 的骨折患者会由于各种原因而发生骨折延迟愈合或不愈合[5]。研究指出，术后骨折区域血液循环不畅引发的局部血肿、水肿是导致骨折延迟愈合或不愈合的主要原因[6]。因此，寻找一种有效促进骨折愈合的药物十分重要。本研究的结果显示，100 ～500 μg/mL 的毛秀才INW- Ⅰ均能有效提高MC3T3-E1 细胞的活性，且随着毛秀才INW- Ⅰ浓度的增加，MC3T3-E1 细胞的活性越高。这说明，毛秀才INW- Ⅰ能提高成骨细胞的活性，促进其增殖。EKR 信号通路是骨细胞增殖和分化的重要通路[7]。临床上普遍认为BMP-2、BMP-4、BMP-7 和BMP-9 具有很强的诱导成骨能力，其中BMP-9 是目前发现诱导成骨能力最强的成骨因子。本研究中我们检测了MC3T3-E1 细胞中ERK1/2 和BMP-9 mRNA、蛋白的表达情况，发现500 μg/mL 的毛秀才INW- Ⅰ对MC3T3-E1细胞中ERK1/2、BMP-9 mRNA 及p-ERK1/2、BMP-9 蛋白的表达均有促进作用。

综上所述，毛秀才INW-Ⅰ可提高MC3T3-E1细胞的活性，促进其增殖。毛秀才INW-Ⅰ可能是通过上调MC3T3-E1 细胞中p-ERK1/2 和BMP-9 的表达而促进细胞的增殖和分化。