水通道蛋白1与非小细胞肺癌的相关性研究

马亚文，Bingling Xu，刘丽华

（1.广西医科大学第一附属医院呼吸内科，广西 南宁 530021；2.Royal Brompton Hospital，England London SW3 6LY）

肺癌（lung cancer）是最常见的恶性肿瘤之一，具有高发病率和高死亡率，是全球死亡率最高的癌症之一，肺癌的5年生存率仅为19%[1]。手术、放疗、化疗和靶向治疗是目前非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）的主要治疗方式，然而晚期NSCLC的生存率仍较低，患者中位生存期仅为10～12 个月[2，3]。肺癌细胞对化疗药物显著的耐药性是晚期癌症进展的主要原因，目前急需探索新的治疗方案，提高肺癌患者的生存期。AQP1 是存在于细胞膜上的水通道蛋白（aquaporins，AQPs）家族中成员，主要促进水的跨细胞转运，并在细胞生命活动和细胞凋亡中发挥重要作用[4]。研究发现[5-8]，AQP1 在乳腺癌、胃癌、前列腺癌、结肠癌等都过度表达，并且已被证明是结肠癌患者预后较差的标志物，但其在肺癌中的作用尚未完全明确。基于此，本研究旨在探讨AQP1 在NSCLC 患者胸膜中的表达情况及对非小细胞肺癌A549 细胞凋亡、增殖功能的影响，以期为NSCLC的治疗提供新的策略。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集广西医科大学第一附属医院2020年5月-2021年10月60 例内科胸腔镜下手术患者的胸膜组织进行石蜡包埋切片，其中非小细胞肺癌胸膜组织标本40 例，良性胸腔胸膜组织标本20 例，患者年龄19～80 岁。纳入标准：患者临床资料完整。排除标准：合并严重心脑肝肾疾病者。

1.2 主要试剂及仪器 A549 细胞及专用培养基（武汉普诺赛生命科技有限公司CM-0016）、AQP1 慢病毒及阴性对照病毒（上海吉凯基因公司）、CCK-8 试剂盒（meilunbio，大连美仑生物公司）、AQP1 抗体（美国Thermo Fisher Scientific 公司，MA5-25401）、AQP1 抑制剂BacopasideⅡ（上海MCE 公司，HYN6016）、胰蛋白酶消化液（0.25%）不含EDTA（索莱宝科技公司）、凋亡试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技有限公司）、多功能酶标仪（美国雷杜Rayto RT-6100）、流式细胞仪（中国达科为生物公司）、DAB 显色试剂盒（武汉塞维尔生物科技有限公司，G1211）。

1.3 免疫组化实验 采用S-P 法对患者标本AQP1表达情况进行测定，用4%的甲醛将收集的标本进行固定，石蜡包埋后进行连续切片，并放入恒温烤箱烤片，采用常规的操作对切片进行脱蜡水化后，用PBS 溶液清洗，并用pH6.0的柠檬酸钠盐缓冲液对抗原进行高压修复。然后将以下试剂依次进行滴加，具体操作如下：内源性过氧化物酶溶液、封闭用非免疫动物血清、一抗孵育过夜、二抗孵育20 min、辣根酶标记链霉卵白工作液孵育10 min、滴加DAB 显色试剂（新鲜配置）显色2 min、并在显微镜下进行染色观察、自来水冲洗、苏木素进行复染、1%盐酸酒精分化2 s、自来水冲洗、脱水和透明处理、中性树胶封片。

1.4 培养细胞及病毒转染 将培养的A549 细胞分别转染AQP1（NM_198098）慢病毒和阴性对照病毒，转染成功后，分别用含有嘌呤霉素的培养基进行筛选稳定株，荧光显微镜下观察表达效果。

1.5 细胞增殖实验 将对照组（正常细胞）、转染过表达AQP1 及阴性对照病毒的稳定株进行培养，待汇合度达80%时，胰酶消化后利用完全培养基重悬细胞，进行细胞计数，取相同数量的细胞接种到96 孔板中，每孔加100 μl 细胞悬液，各设置3 个重复孔，37 ℃培养箱内培养24 h，吸弃原培养基，加入100 μl含有10% CCK-8 增强型溶液的培养基，培养箱内培养0.5 h，用酶标仪测定在450 nm 处的吸光度。

1.6 细胞凋亡流式细胞术检测 收集对照组和抑制剂组（加入AQP1 抑制剂BacopasideⅡ）的细胞，用0.25%EDTA-Free 溶液消化细胞，并收集至1.5 ml离心管中，1000 r/min 离心5 min，吸弃上清液，保留少量液体覆盖细胞沉淀。用预冷磷酸盐缓冲液（PBS）洗2 次，加入Annexin V-AF488 染料2.5 μl，避光染色15 min，加入400 μl Bindingbuffer，混匀后置于流式细胞仪中检测细胞凋亡情况。

1.7 结果判定 AQP1 阳性结果判断：AQP1 蛋白在肿瘤组织中主要表达在细胞膜及细胞胞浆中。根据阳性细胞密度和着色深度进行评分，结果判断标准：①根据阳性细胞密度评定：无阳性细胞数计为0分，阳性细胞所占比例≤10%为1 分，11%～50%为2分，51%～75%为3 分，≥76%为4 分；②根据染色程度进行评分：强棕褐色评为3 分，棕黄色评为2 分，淡黄色评为1 分，无色评为0 分；两项评分的乘积＜1 分为阴性，≥1 分为阳性表达，＜4 分为蛋白低表达，≥4 分为蛋白高表达。

1.8 统计学分析 统计分析及作图软件均使用GraphPad Prism 8.0.1 进行，计量资料采用（±s）表示，组间比较采用方差分析（one-way ANOVA）；计数资料采用[n（%）]表示，采用x2检验或Fisher 精确检验；P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 AQP1 在胸膜组织的表达比较 免疫组化分析显示，良性胸膜组织标本中AQP1 表达较少，非小细胞肺癌胸膜组织标本中AQP1 表达呈强阳性，见图1。且在非小细胞肺癌胸膜组中AQP1 阳性率为80%，良性胸膜组织中AQP1 阳性率为25%。

2.2 获得病毒表达稳定株 通过含有嘌呤霉素的培养基筛选，可获得稳定转染株，荧光显微镜下能检测到绿色荧光，见图2。

2.3 过表达AQP1 促进A549 细胞增殖 相同的培养条件下过表达AQP1，结果可见过表达AQP1 能够促进A549 增殖，见图3。

图3 AQP1 对A549 细胞增殖的作用

2.4 抑制AQP1 表达促进A549 细胞凋亡 与对照组相比，抑制剂组在抑制AQP1 表达后促进了A549细胞早期和晚期的凋亡，对照组和抑制组早期凋亡率分别为0.96%、1.76%，晚期凋亡率分别为0.41%、0.52%，见图4。

图4 AQP1 抑制剂对A549 细胞凋亡的影响

3 讨论

肺癌是癌症死亡的首要原因，NSCLC 约占肺癌总发病率的85%，其发病原因与吸烟、环境污染、呼吸道疾病等密切相关[9，10]。NSCLC 发病较为隐匿，患者确诊时大多已处于中晚期状态，只能通过化疗、放疗等方式延缓其生存期，其预后较差且病死率较高[11]。因此，探索NSCLC的进展机制对改善肺癌患者的预后有重要作用。

AQPS 广泛存在于人体组织中，是水快速跨膜转运的重要物质基础，在细胞新陈代谢、增殖和各种器官生理功能中发挥重要作用[7，12]。AQP1 是存在于细胞膜上水通道蛋白家族中的一员，主要促进水的跨细胞转运，广泛分布于内皮、上皮和特殊细胞中，如红细胞、骨骼肌细胞等，参与多种病理和生理过程[13，14]。AQP1 已在多种肿瘤中被证实可通过促进肿瘤细胞的侵袭、迁移、血管生成在肿瘤的发生发展中发挥重要作用[15-17]。另外，AQP1 对肿瘤患者的预后具有一定影响，如研究发现AQP1 与胰腺导管癌的不良预后相关，在动物研究实验中敲低AQP1可以抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭和肿瘤的发生发展[18，19]。已有研究发现[4，20]，AQP1 是肺腺癌独立的预后标志，并可能通过细胞间充质转化作用增加肿瘤细胞的侵袭性。

本研究结果显示，过表达AQP1 可以增强A549细胞的增殖能力，抑制AQP1的表达则促进了A549细胞早期和晚期的凋亡，且与良性胸膜组织相比，NSCLC 患者胸膜组织中AQP1 呈高表达。据此，推测在NSCLC 中AQP1 可能通过抑制细胞的凋亡从而促进了癌细胞的增殖能力。因此，AQP1 可做为癌症治疗的一个新靶点，可通过降低其在癌细胞中的表达水平来干预肿瘤的进展。此外，已有研究表明AQP1 参与肿瘤转移过程[21]。而本研究收集的NSCLC组织标本均已发生胸膜转移，因此猜测AQP1 可能与NSCLC的胸膜转移有密切关系，但AQP1 与胸膜转移的具体机制尚未完全阐明，未来还需要进一步研究。

综上所述，非小细胞肺癌患者的胸膜组织中AQP1 表达水平高于良性胸膜组织，且在外源性AQP1 刺激作用下能够促进A549 细胞增殖，抑制AQP1的表达可促进A549 细胞的凋亡。但AQP1 通过调节细胞增殖和凋亡影响NSCLC 进展的具体信号通路及分子机制仍不清楚，其中，促进细胞凋亡可能是抑制癌细胞增殖的关键。