金黄色葡萄球菌的耐药机制及治疗进展

陈诗琪，黄珊，谈琦，蓝丽芳，杨涛，温增勇，万春雷，李龙年

（1.赣南医学院2020级硕士研究生；2.赣南医学院第一附属医院皮肤科，江西 赣州 341000；3.上犹县中医院皮肤科，江西 上犹 341200）

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus），也称金葡菌，是厚壁菌门的一种革兰氏阳性非移动凝固酶阳性球菌，是人类皮肤和黏膜表面的常见定植菌，是导致医疗机构和社区感染的重要病原体［1］。定植的金葡菌可通过皮肤或黏膜的裂口引起局部感染，如毛囊炎、疖和痈，严重时产生危及生命的侵袭性感染，如菌血症、脓毒血症、重症肺炎、心内膜炎、骨关节炎以及中毒性休克综合征［2］。随着20世纪40年代青霉素的发现及应用，金葡菌感染病死率明显下降，但青霉素的广泛使用，导致耐青霉素的金葡菌出现［3］。耐青霉素金葡菌通过产生青霉素酶水解青霉素β内酰胺环，而对青霉素产生耐药。随之科学家研发了一种新的耐青霉素酶的半合成青霉素，即甲氧西林［4］。甲氧西林自1959年应用于临床后有效控制了耐青霉素金葡菌的感染。然而，在应用甲氧西林仅2年后，耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）菌株出现［5］。甲氧西林耐药性是由于获得了一个编码青霉素结合蛋白（penicillin binding proteins,PBPs）的新基因mecA，该基因可整合到对甲氧西林敏感的金葡菌的染色体元件（SCCmec）中［6］，从而使这类金葡菌对所有β-内酰胺类抗生素，包括青霉素、头孢菌素和碳青霉烯类耐药［7］。MRSA多重耐药已成为全球公共卫生关注和研究的热点。

1 金黄色葡萄球菌的耐药机制

金葡菌的耐药机制包括天然耐药与获得耐药，天然耐药包括外膜通透性下降、生理性外排系统、β-内酰胺酶的过量产生；获得耐药包括基因突变、耐药基因的获得、生物膜的介导、存留细胞的存在。

1.1 天然耐药

1.1.1 外膜渗透性当细胞膜通透性降低时，细菌的能量代谢受到影响，吸收药物减少，耐药产生［8］。例如，金葡菌对氨基糖苷类药物的耐药是由膜渗透性降低引起药物摄入的减少导致［9］。

1.1.2 外排系统主动外排系统是细菌正常的生理结构，存在于敏感菌株中［10］。当环境中底物长期诱导，细菌外排系统编码基因被激活并表达，外排药物的能力增强，从而导致耐药出现［11］。

主动药物外排系统在对多种药物的耐药性中发挥作用［12］。金黄色葡萄球菌外排系统NorA、NorB、NorC、QacA属于MFS家族，是跨膜质子能驱动型外排系统［13］。其氨基酸序列高度保守，表现为12或14个跨膜蛋白，其中NorA蛋白是金葡菌的主要多药外排蛋白，由位于染色体Sma1D片段上的NorA基因编码。通过质子-药物反向转运机制将抗菌化合物转出细胞膜，NorA可排出大量结构不同的小分子化合物，包括氟喹诺酮类药物、溴化乙啶以及季铵盐类等杀菌剂，使得抗菌敏感性降低［14］。金黄色葡萄球菌的Qac转运系统是由主要易化子超家族QacA和QacR基因构成的质粒编码。QacA也属于多药转运蛋白，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌可通过携带抗消毒剂QacA基因，表达相关转运蛋白，从而对克林霉素、庆大霉素、红霉素、苯唑西林、环丙沙星、四环素及青霉素均有较高的耐药性［15］。多药泵送蛋白都是质子驱动蛋白。也就是说，物质交换不是依靠ATP水解来释放能量，而是通过细胞膜两侧H+形成的电化学梯度来进行的［16］。

1.1.3 β-内酰胺酶β-内酰胺酶即青霉素酶，是一种催化多种β-内酰胺类抗生素（包括碳青霉烯类广谱抗生素）水解的酶，由位于质粒上的blaZ基因编码，具有可转移性［17］。β-内酰胺类抗生素对细菌致死作用的机制：一是与PBPs结合，抑制细胞壁黏蛋白合成，破坏细胞壁；二是触发细菌的自溶酶活性导致细菌溶解［18］。目前的研究表明，MRSA耐药机制主要有两种［19］：一是水解反应，即β-内酰胺酶水解并灭活β-内酰胺类抗生素；二是挤压机制，即大量β-内酰胺酶快速牢固地结合胞外抗生素，阻止抗生素到达胞内空间，因此抗生素无法到达靶位，最终导致MRSA对抗生素耐药［20］。

1.2 获得耐药

1.2.1 基因突变金葡菌可通过靶DNA回旋酶或外膜蛋白的基因突变而产生耐药性，从而减少药物积累［21-22］。例如，对克林霉素和红霉素的耐药性是由核糖体RNA甲基化酶基因突变引起蛋白修饰的改变而引起的［23］。

1.2.2 耐药基因的获得这是一种质粒介导的耐药［24］。质粒介导的转导、转化及耐药基因的插入，可产生过量的β-内酰胺酶，导致细菌耐药［25］。MRSA通过质粒介导获取编码PBPs的mecA基因，mecA基因整合到对甲氧西林敏感的金葡菌染色体元件（SCCmec）中，导致敏感菌株耐药。质粒介导的耐药基因转移可以发生在金葡菌之间，也发生在金葡菌和其他细菌之间［26］。例如，MRSA可以从肠球菌中获得耐药质粒，进一步扩大和增强其耐药性［27］。

1.2.3 生物膜的介导细菌生物膜是由附着在基质表面的微生物种群组成的细胞外复合结构，其内部微生物被自身产生的高度水合的细胞外聚合物基质所包围，是细菌适应周围环境的一种保护性生存方式［28-29］。自然界中绝大多数细菌都以生物膜的形式存在，其最突出的特征是它们强大的黏附力和耐药性，这使得细菌能抵抗宿主的免疫反应，逃避抗生素的杀灭［30］。它们对抗菌药物的耐药性可以是浮游生物的1 000倍。目前，国内外抗生物膜治疗主要集中在新型抗菌药物的研发上［29］。研究发现，生物膜使细菌更易对常规药物产生耐药，而中药与抗生素联合应用可降低细菌耐药的出现［30］。

1.2.4 存留细胞的存在存留细胞是微生物种群中遗传同源但表型异质的一小部分细胞，生长缓慢或休眠，在高浓度抗生素下存活［31］。早期研究表明，与抗生素耐药性不同，细菌存留是细菌暂时抵抗抗生素压力的一种生理状态，不会导致基因型的改变［32］。然而，由于高通量测序技术的快速发展，这种说法受到了挑战。存留细胞的存在给完全消除细菌感染和预防反复感染制造了障碍［31］。现有研究结果表明，细菌存留的机制复杂，相关的信号通路包括毒素-抗毒素系统、细胞生理性能量代谢和蛋白质及核酸合成、DNA保护和修复系统、蛋白酶系统、转译、外泵系统等［31］，具体信号通路及机制仍需大量研究。

2 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药机制

青霉素用于临床不久便发现了耐药菌珠，随后的20年，研究发现，大约80%的菌株通过获取编码β-内酰胺酶的blaZ基因获得了对青霉素的耐药性，该酶通过水解关键的β-内酰胺环使青霉素失活［33］。为应对青霉素耐药在全球范围的内扩散，半合成耐青霉素酶类药物，如甲氧西林以及后来的苯唑西林被开发用于临床。甲氧西林于1961年被引入临床实践，同年晚些时候，在英国一家医院发现了第一个临床MRSA分离株［34］。MRSA对β-内酰胺抗菌药物产生耐药主要原因有两个。其一：MRSA产生β-内酰胺酶从而灭活甲氧西林。β-内酰胺酶是由β-内酰胺酶结构基因blaZ所编码，其表达受到blaR1和blaI基因调控，blaR1基因编码有关信号转导的蛋白blaR1，blaI基因编码blaZ基因负性调控蛋白blaI。在正常状态下，β-内酰胺酶处于抑制状态。当有诱导物存在时，blaZ基因被激活并开始表达，MRSA产生β-内酰胺酶使β-内酰胺环水解，使甲氧西林失效［35］。其二：MRSA获得由mecA编码的与β-内酰胺类抗生素亲和力低的青霉素结合蛋白2a（penicillin binding protein 2a,PBP2a），其由mecA基因编码。mecA基因存在于一个被称为SCCmec的结构复杂的遗传元件家族中，这些元件通常携带额外的基因，赋予对其他抗生素和有害物质（如重金属）的耐药性［36］，一些证据表明，SCCmec进化发生在sciur葡萄球菌群中，这是经常在家畜的皮肤上定居的葡萄球菌的一个原始群体［37］。PBP2a与属于sciur葡萄球菌群编码的原生PBPs非常相似。但是，把一个祖先基因进化成一个抗性决定因子需要大量的基因改变［37］。与这一发现相一致的是，在引进甲氧西林之前，青霉素和其他第一代β-内酰胺类抗生素的广泛使用似乎是金黄色葡萄球菌选择携带mecA抗性的决定因素［38］。mecA基因转录受mecI-mecR1和blaI-blaR1两套调控基因的调控；mecI、mecR1基因分别编码抑制蛋白mecI与传感器蛋白mecR1，blaI、blaR1基因分别编码抑制蛋白blaI与诱导蛋白blaR1。对于MRSA菌株，其大部分耐药是由mecA基因介导，但是小部分MRSA不携带mecA基因，存在其他耐药机制。在许多研究中发现，90%以上的MRSA都含有mecA基因，并且对β-内酰胺类抗菌药物高度耐药的MRSA中mecA的检出率极高［35］。

3 针对MRSA的抗生素研究以及治疗新策略

MRSA具有易感染、高死亡率和多重耐药的特点，目前已成为临床治疗的绊脚石［4］。如何有效预防和控制MRSA也成为研究热点。目前MRSA的一线治疗通常包括服用大剂量抗生素，包括万古霉素、利奈唑胺或头孢他林；然而，在过去20年中，出现了对这些抗生素耐药的临床分离菌［39］。抗生素耐药性通过阻止对细菌、寄生虫、病毒和真核病原体的有效治疗而威胁全球健康，滥用或过度使用抗生素将加速耐药变体的选择［40］。由于所有生物体都进化出了基因突变来防止致命的选择压力，抗生素耐药性是不可避免的进化结果。如今，抗生素的耐药性普遍存在，新药的供应已经耗尽。因此，迫切需要替代策略和新型抗菌剂来解决抗生素耐药性问题［41］。

从分子水平对耐药菌株耐药机制的深入研究，促进了新药研发的进展。目前研发中的大多数小分子抗生素和最近批准的小分子抗生素多是对现有抗生素化学支链的修饰。因此，抗生素的交叉耐药性可以出现，正如对最近批准的氟喹诺酮类药物地拉沙星的耐药［42］。不过，新的膜靶向抗生素正在开发中，如非肽防御素模拟药物磷酸二酯酶4的新型抑制剂brilacidin。brilacidin虽然在结构上与环脂肽类抗生素达托霉素不同，但是细胞效应与达托霉素相似［43］。寻求新的治疗的另一个途径是通过抑制获得性耐药机制或抑制抗生素耐药所需的核心细胞功能来重新使耐药株敏感［42］。另外，影响编码青霉素结合蛋白PBP2a的表达也是增加MRSA对β-内酰胺类药物易感性的方法，抗精神病药物噻利嗪证明了这一点，它降低了Meca和blaZ的转录和PBP2a的表达［44］。也有联合治疗的方案报道，如硫唑嘌呤联合双氯西林对VISA菌株具有抑制作用［45］。

目前极具潜力的是替代治疗策略，包括抗体治疗、抗病毒治疗、噬菌体和疫苗［46］。抗体治疗目前正研发的有两种类型，即与病原体结合以促进调理吞噬作用的抗体和中和毒性因子如毒素的抗体［47］。金葡菌具有多种毒力因子，单一因子的中和作用通常不足以对抗金葡菌感染，因此，结合不同靶标的单克隆抗体的混合物正在研发中。抗病毒治疗的策略是解除参与疾病进展的关键毒力因子，细菌清除依赖于功能性免疫系统或联合使用抗生素［48］。已证明靶向金葡菌控制其毒力因子产生的调控因子介导的群体感应系统进而抑制主要毒力因子如α-溶血素对金葡菌的定植和感染都有影响［49］。噬菌体是专门针对细菌的病毒，随着抗生素的应用，噬菌体疗法被舍弃。但抗生素耐药性带来的困难重新激起了医学对噬菌体疗法的兴趣。目前已有几种针对金葡菌的噬菌体疗法正在测试［50］。

总之，金葡菌特别是MRSA的耐药机制复杂，相关分子靶点和信号通路仍需大量研究。目前有一系列新的治疗选择正在探索中，不久的将来这些新的治疗策略将揭示它们对金葡菌感染的疗效和治疗潜力。