淡豆豉提取物不同溶剂萃取物的抗氧化活性

刘俊泽 胡力铭 王仁广 王淑敏 王 欢

(长春中医药大学，吉林 长春 130117)

淡豆豉(fermented soya beans)是豆科植物大豆(黑豆)的成熟种子与中药青蒿、桑叶经发酵得到的加工品[1]，是一种历史悠久的健康食品[2]，被卫生部列在中国首批药食两用名单中[3]。其含有多种天然活性成分，如大豆异黄酮、豆豉多糖、大豆皂苷、大豆低聚糖、维生素以及发酵过程中产生的纤溶酶、γ-氨基丁酸等[4-5]，具有降血脂、降血压、抗氧化、免疫调节、预防骨质疏松等保健作用[6-7]；临床上还可用于治疗感冒、寒热头痛、烦燥胸闷、虚烦不眠等病症[8]。目前淡豆豉抗氧化活性的研究主要集中于大豆异黄酮类、豆豉多糖、大豆皂苷等成分，但有关淡豆豉粗提物不同溶剂萃取物抗氧化活性成分的研究尚未见报道。

自由基是一种广泛存在于人体细胞中的游离基[9]，与人体的新陈代谢、正常生长发育以及疾病发生等有着密切的联系。研究发现，淡豆豉中的多糖[10]、异黄酮[11]、大豆皂苷等成分在体外表现出良好的自由基清除能力，可被用作天然抗氧化剂添加到食品中。试验拟采用70%乙醇对淡豆豉进行提取，并用不同溶剂对粗提物进行萃取，测定粗提物与各萃取物中总黄酮、总多糖以及6种大豆异黄酮含量，评价粗提物与不同溶剂萃取物对DPPH自由基、ABTS自由基、OH自由基的清除能力，并进行相关性分析，以期为进一步研究和开发淡豆豉抗氧化食品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

淡豆豉：批号36919004，经长春中医药大学药学院王淑敏教授鉴定为豆科植物大豆Glycinemax(L.)Merr.的干燥成熟种子(黑豆)的发酵加工品，河北仁心药业有限公司；

芦丁、1，1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)：分析纯，上海源叶生物科技有限公司；

大豆苷元、大豆苷、染料木素、染料木苷、黄豆黄素、黄豆黄苷标准品：批号分别为DST191011-020、DST190819-019、DST190915-002、DST200319-003、DST190819-009、DST1903312-008，HPLC≥98%，成都德斯特生物科技有限公司；

2，2′-联氨-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺盐(ABTS)：分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；

过硫酸钾：分析纯，上海沃凯生物技术有限公司；

L-抗坏血酸、硫酸亚铁、水杨酸、过氧化氢、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠：分析纯，天津市光复精细化工研究所；

无水乙醇、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇：分析纯，天津市永大化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

高效液相色谱仪：LC-2030型，岛津(中国)有限公司；

多功能酶标仪：Infinte M200 Pro型，TECAN帝肯(中国)有限公司；

双光束紫外可见分光光度计：TU-1901型，北京普析通用仪器有限责任公司；

万分之一电子天平：ME204E型，梅特勒—托利多国际有限公司；

旋转蒸发仪：RE-52AA型，上海亚荣生化仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 样品的制备 称取200 g淡豆豉干燥粉末，以料液比(m淡豆豉∶V乙醇)1∶10 (g/mL)加入70%乙醇[12-13]，超声处理(120 W，40 kHz)1 h，重复3次，合并提取液，过滤，减压浓缩，干燥至恒重，得50.54 g浸膏。

取32.00 g浸膏，加水制成悬浊液，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取，共3次，合并萃取液，过滤，减压浓缩，干燥至恒重得不同极性部位萃取物。分别取适量粗提物及各溶剂萃取物，用70%乙醇配制成2.0 mg/mL 的溶液作为供试品。

1.2.2 总黄酮含量测定 参照文献[14-15]稍作修改，分别吸取3 mL粗提物及各溶剂萃取物供试品于10 mL具塞试管中，加入5%亚硝酸钠溶液0.40 mL，静置6 min；加入10%硝酸铝溶液0.40 mL，静置6 min；加入4%氢氧化钠溶液4.0 mL，混匀，静置15 min。以芦丁作为对照品制作标准曲线；以70%乙醇代替各供试品溶液作为空白对照。测定506 nm处吸光度，计算粗提物与各萃取物中总黄酮含量，结果以每克萃取物含有的总黄酮的毫克数表示(mg/g)。

1.2.3 总多糖含量测定 参照文献[16]稍作修改，将各供试品溶液稀释至0.5 mg/mL，各取1 mL于10 mL具塞试管中，加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀；加入浓硫酸5 mL，摇匀，室温下避光反应20 min。以无水葡萄糖作为对照品制作标准曲线；以70%乙醇代替各萃取物溶液作为空白对照。测定490 nm处吸光度，计算粗提物与各萃取物中总多糖含量，结果以每克萃取物含有的总多糖的毫克数表示(mg/g)。

1.2.4 大豆苷等6种大豆异黄酮含量测定 色谱柱为安捷伦 ZORBAX Extend-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为0.1%磷酸(A)—乙腈(C)；柱温30 ℃；流速1 mL/min；进样量10 μL，检测波长254 nm；梯度洗脱程序为0～5 min，17% A；5～26 min，17%～28% A；26～30 min，28% A；30～33 min，28%～30% A；33～38 min，30%～35% A；38～43 min，35% A；43～45 min，35%～17% A；55 min，17% A。对萃取物中6种异黄酮类成分进行指认，并根据各化合物峰面积与相应化合物标准曲线进行定量，结果以每克萃取物所含该种异黄酮的毫克数表示(mg/g)。

1.2.5 DPPH自由基清除能力测定 根据文献[17]，并按式(1)计算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

c——自由基清除率，%；

A2——供试品溶液吸光度值；

A1——空白对照组溶液吸光度值；

A0——溶剂代替不同供试品溶液吸光度值。

1.2.6 ABTS自由基清除能力测定 根据文献[18]，并按式(1)计算ABTS自由基清除率。

1.2.7 OH自由基清除能力测定 根据文献[19]，并按式(1)计算OH自由基清除率。

1.3 数据统计与分析

采用Excel 2010、SPSS 26.0、GraphPad Prism 8.0软件对数据进行单因素方差分析(ANOVA)、相关性分析及图像绘制，所有试验重复3次，结果表示为(x±s)。

2 结果与分析

2.1 含量分析

2.1.1 总黄酮、总多糖含量 由表1可知，乙酸乙酯萃取物的总黄酮含量最高为(92.912±1.130)mg/g，其次为正丁醇萃取物，说明淡豆豉中的黄酮类成分大多为中等极性。正丁醇萃取物中的总多糖含量最高为(83.381±0.754)mg/g，其次是萃余物、70%乙醇粗提物、乙酸乙酯萃取物。说明淡豆豉中所含有的黄酮、多糖类化学物质可被中强极性(乙酸乙酯、正丁醇)溶剂富集，推测这些物质属于中强极性物质。

表1 粗提物与不同溶剂萃取物中总黄酮、总多糖含量测定结果†Table 1 Determination results of total flavonoids,and total polysaccharides in crude extract and different solvent extracts

2.1.2 6种大豆异黄酮含量 由图1和表2可知，正丁醇萃取物中的大豆苷、染料木苷、大豆苷元、染料木素含量均显著高于其他萃取物，含量分别为(2.042±0.053)，(8.074±0.006)，(21.366±0.117)，(11.686±0.003)mg/g。黄豆黄苷在乙酸乙酯萃取物中富集最多，达(4.917±0.026)mg/g。黄豆黄素在二氯甲烷萃取物中含量最高，为(4.664±0.011)mg/g。综上，正丁醇可以较好地萃取淡豆豉中的异黄酮成分，其次为乙酸乙酯，而萃余部位中的6种异黄酮含量低于检测限。

1.大豆苷 2.黄豆黄苷 3.染料木苷 4.大豆苷元 5.黄豆黄素 6.染料木素 S1.萃余物 S2.石油醚萃取物 S3.二氯甲烷萃取物 S4.乙酸乙酯萃取物 S5.70%乙醇粗提物 S6.正丁醇萃取物 S7.6种大豆异黄酮混标图1 粗提物与各溶剂萃取物HPLC色谱图Figure 1 HPLC chromatograms of the crude extract and the solvent extracts

表2 粗提物与各溶剂萃取物中6种异黄酮含量†Table 2 Determination results of 6 isoflavones in crude extract and solvent extracts mg/g

2.2 抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基清除活性 由图2可知，淡豆豉粗提物与各溶剂萃取物对DPPH自由基的清除作用均呈现一定的量效关系。其中，正丁醇萃取物与乙酸乙酯萃取物对DPPH自由基的清除能力较强，IC50分别为(0.371±0.007)，(0.499±0.007)mg/mL，在质量浓度范围内，二者对DPPH自由基的清除作用虽弱于抗坏血酸，但随质量浓度的升高，其对DPPH自由基清除作用可能会进一步增强；其次为70%乙醇粗提物部位，其对DPPH自由基清除率的IC50为(0.867±0.020)mg/mL；萃余物与二氯甲烷萃取物对DPPH自由基的清除作用较接近，IC50分别为(1.216±0.098)，(1.814±0.037)mg/mL；石油醚萃取物对DPPH自由基的清除能力最弱。

图2 粗提物、各溶剂萃取物的DPPH自由基清除活性Figure 2 DPPH free radical scavenging activity of crude extracts and solvent extracts

2.2.2 ABTS自由基清除活性 由图3可知，随着粗提物与各溶剂萃取物质量浓度的升高，ABTS自由基的清除能力也增强，其中抗坏血酸对ABTS自由基的清除能力明显高于粗提物和各萃取物。正丁醇萃取物对ABTS自由基的清除能力优于粗提物与其他萃取物，其IC50为(0.199±0.003)mg/mL；其次为乙酸乙酯萃取物和70%乙醇粗提物，IC50分别为(0.203±0.008)，(0.264±0.003)mg/mL；除正丁醇萃取物外，其余萃取物在质量浓度为0.0～0.2 mg/mL时，对ABTS自由基的清除能力接近，当质量浓度>0.2 mg/mL时，乙酸乙酯萃取物的清除能力略高于70%乙醇粗提物和二氯甲烷萃取物；萃余物与二氯甲烷萃取物清除ABTS自由基的IC50分别为(0.405±0.010)，(0.336±0.008)mg/mL，较为接近；石油醚萃取物对ABTS自由基的清除能力最弱。

图3 粗提物、各溶剂萃取物的ABTS自由基清除活性Figure 3 ABTS free radical scavenging activity of crude extracts and solvent extracts

2.2.3 OH自由基清除活性 由图4可知，淡豆豉粗提物与各溶剂萃取物对OH自由基均具有一定的清除作用，且趋势相近，其中正丁醇萃取物清除OH自由基能力优于粗提物及其他萃取物，IC50为(0.162±0.002)mg/mL，当样品质量浓度<0.4 mg/mL时，正丁醇萃取物与抗坏血酸对OH自由基的清除能力相近，当质量浓度>0.4 mg/mL 时，抗坏血酸的清除能力优于正丁醇萃取物；其次为乙酸乙酯萃取物，IC50为(0.166±0.006)mg/mL，略低于正丁醇萃取物；70%乙醇粗提物、二氯甲烷萃取物、石油醚萃取物及萃余物对OH自由基的清除能力较弱，最弱为石油醚萃取物。

图4 粗提物、各溶剂萃取物的OH自由基清除活性Figure 4 OH radical scavenging activity of crude extract and solvent extracts

2.3 抗氧化能力与总黄酮、总多糖及6种异黄酮含量的相关性

由表3可知，总黄酮含量与DPPH自由基、ABTS自由基和OH自由基的清除能力显著相关(P<0.05)；总多糖含量与DPPH自由基的清除能力极显著相关(P<0.01)，与ABTS自由基的清除能力显著相关(P<0.05)。总黄酮含量与6种大豆异黄酮含量均表现出相关性，异黄酮中的大豆苷、大豆苷元、染料木苷及染料木素含量与3种自由基的清除能力极显著相关(P<0.01)；黄豆黄苷含量与DPPH自由基和OH自由基的清除能力极显著相关(P<0.01)，与ABTS自由基的清除能力显著相关(P<0.05)。

表3 抗氧化能力与总黄酮、总多糖及6种异黄酮含量的相关性†Table 3 Correlation analysis of antioxidant capacity and content of total flavonoids,total polysaccharides and 6 kinds of isoflavones

3 结论

采用3种体外抗氧化活性评价方法，对淡豆豉粗提物的不同极性溶剂萃取物的抗氧化活性进行了研究。结果表明，正丁醇萃取物的抗氧化活性高于其他萃取物，其总多糖含量最高，总黄酮含量仅次于乙酸乙酯萃取物的，且其中的大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素含量明显高于粗提物及其他萃取物的。由相关性分析结果可知，总黄酮含量与3种抗氧化活性指标的相关性最大，总多糖含量的次之。3种抗氧化活性指标与大豆异黄酮中的大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素含量极显著相关(P<0.01)，与黄豆黄苷含量显著相关(P<0.05)。综上，总黄酮中的大豆异黄酮类成分是发挥抗氧化活性的主要物质，特别是大豆苷、大豆苷元、染料木苷、染料木素这4种大豆异黄酮，而正丁醇可以较好地萃取淡豆豉中的这4种大豆异黄酮，是抗氧化成分的最优萃取溶剂。淡豆豉在发酵过程中，结合型的大豆异黄酮糖苷转化成游离型的大豆异黄酮苷元，使其具备更强的抗氧化能力；此外，淡豆豉的发酵工艺以及引入的辅料青蒿、桑叶对淡豆豉的抗氧化活性影响有待进一步探究；后续将继续探究淡豆豉的炮制工艺，以及淡豆豉中大豆皂苷、大豆蛋白等其他成分与抗氧化活性间的关系以及作用机理。