利用高通量测序分析乳酸杆菌发酵液对人体面部皮肤微生态的影响

王梓诺 王耀华 刘家栋 陆 震 赵 毅 庄 洁 温亮亮

华熙生物科技股份有限公司上海研发中心，上海，200120

皮肤微生态指的是由皮肤表面的宿主细胞及分泌物、各类微生物，以及所处的微环境组成的生态系统，它们共同维持着皮肤平衡[1-3]。人体皮肤表面微生物种类繁多，按照在皮肤上存在时间的长短进行分类，可以将这些微生物分为常驻菌群和暂驻菌群[4]，皮肤表面常见的常驻菌有棒状杆菌属、短杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、丙酸杆菌属、微球菌属、马拉色菌属[5]等。此外，皮肤表面生存的益生菌有利于调理皮肤，维持皮肤微生态平衡，代表的益生菌有乳酸杆菌和双歧杆菌[6]等，不少化妆品中都会添加益生菌发酵液来保护皮肤屏障，已经有文章证实，乳酸杆菌发酵液可以显著清除自由基,促进Nrf-2蛋白的活化，激发皮肤细胞的抗氧化活力[7]，因此将乳酸杆菌等益生菌的发酵液利用到化妆品当中具有广阔前景。

科研人员热衷于探究皮肤微生态的规律，但是由于皮肤表面微生物种类复杂繁多，仅仅依靠传统分离培养的方法已无法进行深入探究。高通量测序技术（high-throughput sequencing，HTS）由于其高通量、测序快、准确度高的优点，为皮肤表面微生物检测带来了新的希望，现已应用在微生物学、生态学、食品科学、环境科学、遗传病的诊断、植入前遗传学检测等多个领域[8-10]。按照其测序覆盖范围大小可分为：全基因组测序、全外显子组测序、靶向目标基因测序[11,12]。尽管高通量测序已经有了一定的发展，但是在化妆品皮肤微生态领域，其应用仍然存在很多不足。基于以上，本实验利用高通量测序技术，对使用乳酸杆菌发酵液前后的脸部皮肤微生态进行分析比较，并结合生物信息学知识，对脸部皮肤菌群进行揭示，为证明高通量测序能够有效分析皮肤微生态提供实验支持。

1 实验部分

1.1 实验流程

1.1.1 志愿者选择

召集10位实验志愿者，年龄25～35岁，性别比例随机，受试部位无痤疮、皮炎、湿疹等皮肤病变。要求志愿者每天早、晚各一次全脸涂抹5%乳酸杆菌发酵液水溶液，并在采样前12 h避免清洗采样皮肤部位。

1.1.2 采样过程

将一次性无菌采样拭子用无菌生理盐水润湿后触及采样区域，保持拭子的轴平行于皮肤表面，并施加稳定的压力,在约3 cm2的区域内沿垂直方向擦拭皮肤表面10次。按上述方法分别采集额头、鼻翼和脸颊上的皮肤样品，在该乳酸杆菌发酵液使用前（即第0天）、使用后第7天、第14天分别取样，总计3次；每次固定在额头、鼻翼、脸颊3个部位取样，采样后冻存于-70℃待进行微生物基因组DNA提取。

1.2 实验方法

1.2.1 基因组DNA抽提

提取全基因组DNA，并利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA。

1.2.2 PCR扩增

按指定测序区域（16s v3v4区），合成带有5’ barcode的特异引物。全部样品按照正式实验条件进行PCR扩增，并用2%琼脂糖凝胶电泳检测并进行胶回收符合目的的PCR产物。

1.2.3 荧光定量

参照电泳初步定量结果，将PCR胶回收产物用Qubit进行检测定量，之后按照每个样品的测序量要求，进行相应比例的混合。

1.2.4 文库的建立及Miseq上机测序

使用TruSeq DNA HT Sample Prep Kit，MiSeq Reagent Kit v3构建扩增子文库，最后在Illumina Hiseq 2500测序平台上测序。

1.2.5 生物信息分析与数据处理

利用qiime2软件中dada2包对测序数据的Read1和Read2进行拼接，形成feature表，基于feature聚类分析结果，对feature进行多种多样性指数分析，以及对测序深度的检测。

使用Uparse软件将序列同源性≥97%的有效序列聚类为同一OTUs；细菌对Observedspecies和Shannon指数进行正态分布检验后，用SPSS16.0软件计算各组内的均数±标准差；运用T检验检测组间的α多样性差异有无统计学意义；对测序序列进行随机抽样的方法，以抽到的序列数与它们所能代表OTU的数目构建稀释性曲线，应用Mothur软件(V1.33.3)计算分子方差分析(Anova)，评估组间群落结构差异有无统计学意义；应用T检验确定两组间相对丰度存在差异的物种。

2 结果与分析

2.1 α多样性

图1分别为不同组的α多样性指数的比较箱线图，并给出了不同组之间的差异P值。

图1 第0d、7d、14d取样的α多样性指数箱线图 A.Chao1指数；B.观察种数；C.Shannon指数；D.Simpson指数。

多样性结果显示，在使用该乳酸发酵液的第0天、第7天、第14天，皮肤表面菌群种类具有显著性差异（P＜0.05），且与使用前相比，Shannon指数和Simpon指数随着使用时间的增加呈现了一定程度的下降趋势；Chao1指数和Observed指数在第7天呈现较为明显的降低，在第14天又有了一定的回升趋势，但整体来说第14天时Chao1指数和Observed指数降低，由此分析，使用该乳酸发酵液14d降低了皮肤表面菌群多样性。

2.2 β多样性分析

使用化妆品后皮肤菌群的β多样性分析见图2。

由图2可知，随着乳酸杆菌发酵液使用时间的延长（7～14 d），使用相同天数的样品能够明显聚类，且与0天样品能显著区分开，表明乳酸杆菌发酵液的使用对面部皮肤菌群组成产生了显著的影响。

图2 使用化妆品后皮肤菌群的β多样性分析 A.于jaccard算法；B.基于未加权UniFrac距离；C.基于NMDS算法；D.PCA分析

2.3 物种组成分类情况

2.3.1 门水平的群落结构

面部皮肤菌群门水平组成见图3。

图3 面部皮肤菌群组成（门水平）

在门水平，无论是使用前还是使用后，虽然有丰度上增加或减少的差别，但是整体来讲都是变形菌门（p-Proteobacteria）、放线菌门（p-Actinobacteria）、厚壁菌门（p-Firmicutes）、拟杆菌门（p-Bacteroide）所占比例最大，说明面部皮肤上变形菌门、放线菌门、厚壁菌门、拟杆菌门为优势菌。相对于使用前，使用14d的结果显示放线菌门丰富度增加；厚壁菌门丰富度先增加，后有减少趋势，但与0d相比，其相对丰度还是呈现增加趋势；变形菌门丰度减少；拟杆菌门丰度减少；疣微菌门（p-Verrucomicrobia）丰度减少（P＜0.05）。由于变形菌门中包括很多病原菌，如大肠埃希菌、沙门菌、霍乱弧菌等，它们的减少在一定程度来说有可能降低对于皮肤健康的威胁，同样地，拟杆菌纲的很多种类生活在人体肠道中，在某些情况下会成为致病菌，对于皮肤而言其丰度降低也是有益的。因此，在一定程度上说明使用该乳酸杆菌发酵液有益于皮肤微生态。

2.3.2 属水平的菌落结构

面部皮肤菌群属水平组成见图4。

图4 面部皮肤菌群组成（属水平，相对丰度前20）

结合单变量统计分析发现，使用14d后，在属水平上，面部皮肤菌群中乳杆菌属（Lactobacillus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）等的相对丰度增加，别样杆菌属（Alistipes）、罗尔斯顿菌属（Ralstonia）、肠球菌属（Enterococcus）和铜绿假单胞菌属（Pseudomonas）等的相对丰度减少。

3 结论

高通量测序技术的发展使人们对于皮肤微生态有了更加深入的认知，通过高通量测序，能够对皮肤表面的菌群从门、属等水平进行分类，同时能够借助生物信息学分析皮肤表面微生物群落的多样性及不同群落之间的多样性，这为认识复杂庞大的皮肤微生态提供了有力的支持。

在本实验中，让10名志愿者涂抹乳酸杆菌发酵液，并分别在使用乳酸杆菌发酵液之前第0天，之后第7天、第14天进行取样测序，测序结果说明使用乳酸杆菌发酵液对面部皮肤菌群组成产生了显著的影响。本次实验由于人员、时间等的限制，仅进行到第14天，而第14天的Chao1指数和Observed有了一定的回升，故不排除一部分菌群对乳酸杆菌发酵液产生了耐受性，后续多样性有继续上升的可能，这有待于进一步论证；人体面部皮肤以变形菌门、放线菌门、厚壁菌门、拟杆菌门为优势菌种；门水平的结果还提示使用乳酸杆菌发酵液后，可能在一定程度增加皮肤常驻菌的丰度，降低大肠埃希菌、霍乱弧菌等致病菌的丰度；属水平的结果显示，使用该乳酸杆菌发酵液能够增加面部皮肤中乳杆菌属（Lactobacillus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、双歧杆菌属（Bifidobacterium）等的相对丰度，减少别样杆菌属（Alistipes）、罗尔斯顿菌属（Ralstonia）、肠球菌属（Enterococcus）和绿脓杆菌属（Pseudomonas）等的相对丰度，皮肤表面常驻菌—葡萄球菌属、益生菌—双歧杆菌属和乳杆菌属的增加在一定程度上反映了使用该乳酸发酵液可能有利于皮肤微生态。

不难发现，利用高通量测序技术，结合生物信息学分析，能够检测出使用相关化妆品前后皮肤表面微生态的变化，有利于对皮肤微生态进行深入分析，能够为化妆品在皮肤微生态方面的发展提供科学指导。