结直肠腺瘤性息肉中医证型与病理类型和粪便多配体聚糖2基因甲基化的相关性

张强 王再见 李会霞 李彤 雷雪 曲冬梅

1 对象与方法

1.1 对象

选取2020年01月至2021年06月就诊于北京中医药大学第三附属医院的310例APs患者，其中男性为186例，女性为124例，年龄38～74岁，平均年龄62(52，67)岁；其中管状腺瘤222例，管状绒毛状腺瘤66例，绒毛状腺瘤22例，低级别上皮内瘤变281例，高级别上皮内瘤变29例。另选取肠镜及病理检查无异常的健康体检者75例为正常对照组，其中男性47例，女性28例，年龄31～72岁，平均年龄62(49，67)岁。APs组与正常对照组在年龄和性别方面，差异无统计学意义(P>0.05)。本研究通过医院医学伦理委员会审查(编号：ECGZRSL-ZYDSY2021-13)，同意开展相关研究，所有研究对象签署知情同意书。

1.2 诊断标准

结直肠腺瘤性息肉的现代医学诊断标准参照美国结直肠癌多学会工作组制定的《结肠镜检查及息肉切除术后随访建议(2020年)》[6]、世界卫生组织(WHO)制定的《消化系统肿瘤分类(2019年)》[7]和中华医学会制定的《胃肠道腺瘤和良性上皮性息肉的病理诊断共识(2020年)》[8]。中医证型诊断标准参照国家中医药管理局重点专科专病项目组制订的《大肠息肉(结肠息肉)中医临床路径》和中华中医药学会发布的《中医内科常见病诊疗指南—西医疾病部分》[9]和《中药新药临床研究指导原则》[10]中有关胃肠疾病中医证型诊断的相关内容，并结合高年资医生的临床经验，分为大肠湿热证、湿瘀阻滞证、脾虚湿蕴证和气滞血瘀证。

1.3 纳入标准

(1)年龄≥18岁；(2)肠道准备良好并完成全结肠检查(结肠镜到达回盲瓣)；(3)经肠镜和病理检查符合上述现代医学诊断标准；(4)中医四诊信息记录完全，符合上述中医证型诊断标准。

1.4 排除标准

(1)肠道准备不充分，影响观察者；(2)水样便或不能收集大便者；未完成病理学检查者；(3)诊断为结直肠恶性肿瘤、炎症性肠病、缺血性肠炎或非特异性肠炎者；(4)合并有严重呼吸、心脑血管疾病或内分泌等疾病者；(5)临床资料不完整者。

1.5 病例信息采集及临床资料检测

制定临床调查问卷，由经副高或以上级别医生指导培训合格的调查专员收集受检者的临床资料，包括：(1)年龄(<60岁、≥60岁)；(2)性别(男、女)；(3)中医四诊信息(神态、面色、寒热、腹部症状、大便情况、舌脉等)；(4)腺瘤数量(单发、多发)；(5)腺瘤大小(<10 mm、≥10 mm)；(6)组织学类型(管状腺瘤、管状绒毛状腺瘤、绒毛状腺瘤)；(7)上皮内瘤变程度(低级别、高级别)；(8)粪便SDC2基因甲基化检测结果。中医证型由具有5年工作经验的主治中医师根据患者的症状、体征和舌脉进行诊断，然后由另外一位具有相同工作经验的主治中医师进行审核，若两位中医师有不同的辨证意见，则请一位具有10年工作经验的副主任及以上的中医师进行辨证分型，取意见一致者为最终辨证结果。结肠镜检查由3年以上操作经验的主治医师或副主任医师使用奥林巴斯GIF HQ290肠镜(奥林巴斯光学，日本，京东)进行操作，术前波士顿肠道准备量表评分≥9分，退镜时间≥6分钟。肠镜下取得标本后，用福尔马林固定，由2位不知患者内镜结果的病理医师以世界卫生组织的诊断标准[7]分别进行病理诊断。其中多发腺瘤，直径记录最大者，病理记录恶性程度最高者。在肠镜检查前使用人类SDC2基因甲基化检测试剂盒(荧光PCR法)(广州市康立明生物科技有限责任公司)的采集装置收集受检者5～10 g粪便，标记后于-80℃冰箱内由广州康立明生物医学检测实验室在粪便样本采集36小时内进行粪便SDC2基因甲基化检测。

1.6 粪便SDC2基因甲基化检测

粪便SDC2基因甲基化检测包括DNA的提取、亚硫酸盐的处理和荧光定量PCR等过程。首先用磁珠捕获的方法提取人粪便样本中的SDC2基因和β-肌动蛋白(ACTB)基因，然后用亚硫酸盐将未发生甲基化的DNA进行转化。在同一个反应孔中，采用双重荧光PCR检测甲基化的SDC2基因及ACTB基因保守序列，甲基化的SDC2基因通过扩增后由羧基荧光素标记的荧光探针报告扩增信号，ACTB基因扩增后由Texas Red标记的荧光探针报告扩增信号，计算ACTB基因和SDC2基因的循环阈值(cycle threshold，Ct)。根据人类SDC2基因甲基化检测试剂盒的设定，ACTB基因的Ct值≤36，甲基化SDC2基因Ct值≤38时判断样本为阳性；ACTB基因的Ct值≤36，甲基化SDC2基因Ct值>38时判定为阴性样本；ACTB基因Ct值>36或者无Ct值时，判定为样本不合格。

1.7 研究方法

观察APs不同年龄分层、性别、腺瘤数量、大小、组织学类型和上皮内瘤变的粪便SDC2基因甲基化特征，比较APs各证型间年龄分层、性别、腺瘤数量、大小、组织学类型、上皮内瘤变和粪便SDC2基因甲基化的差异，观察APs各证型粪便SDC2基因甲基化阳性患者病理特征，分析APs中医证型与组织学类型、上皮内瘤变和粪便SDC2基因甲基化的相关性。

1.8 统计学方法

所有数据均采用SPSS 24.0软件进行数据统计分析。本研究中，年龄为计量资料，经正态性检验不符合正态分布，以中位数(M)和第25，75百分位数(P25，P75)表示，采用Mann-Whitney U检验比较APs和正常对照组两组间年龄差异。APs各证型的年龄分层、性别、腺瘤数量、腺瘤最大直径、组织学类型、上皮内瘤变和粪便SDC2基因甲基化等资料为计数资料，以频数和百分比表示，多组间比较采用Pearsonχ2检验或似然比χ2检验，两两比较采用Pearsonχ2检验或连续校正χ2检验。采用Spearman相关系数法观察中医证型与组织学类型、上皮内瘤变和粪便SDC2基因甲基化的相关性，以P<0.05为差异有统计学意义。

楼下的小商贩里，还有一位卖菜的小伙子，眉清目秀的，透着精干劲儿。一般卖菜的都是老头或老太太，小伙子在其中格外显眼。有人打趣说：“你一个大小伙子，干点啥挣得都少不了，干嘛跑这里卖菜？”小伙子哈哈一笑说：“我在这里待的时间不会太长，我卖菜其实就是做点市场调查，为以后搞蔬菜大棚做准备。大伙儿发现没有，现在大棚蔬菜很有市场，我打算过一阵回老家，承包几亩地，种大棚蔬菜。到时候，大爷大娘们到我那里进菜哦，肯定给你们实惠价……”大伙儿都觉得他说的这些没影儿的事很无趣，没几个人搭茬，经常是他一个人双眼放光地自说自话。

2 结果

2.1 APs各证型临床病理特征

310例APs患者中，大肠湿热证78例、湿瘀阻滞证76例、脾虚湿蕴证81例、气滞血瘀证75例。如表1，APs各证型在年龄、性别及腺瘤数量及大小方面，差异均无统计学意义(P>0.05)。

表1 APs各证型年龄、性别及腺瘤数量和最大直径情况

如表2，APs以管状腺瘤为主，管状绒毛状腺瘤和绒毛状腺瘤占比较低。各证型在组织学类型方面，差异具有统计学意义(P<0.05)；其中各证型在管状腺瘤和绒毛状腺瘤占比方面，差异有统计学意义(P<0.05)；但在管状绒毛状腺瘤占比方面，差异无统计学意义(P>0.05)。大肠湿热组(79.49%)管状腺瘤占比高于气滞血瘀组(62.67%)，气滞血瘀组管状绒毛状腺瘤和绒毛状腺瘤合计占比为37.33%，高于大肠湿热组(20.51%)和脾虚湿蕴组(22.22%)，差异具有统计学意义(P<0.05)。湿瘀阻滞组(13.16%)绒毛状腺瘤占比高于大肠湿热组(2.56%)和脾虚湿蕴组(2.47%)，差异均具有统计学意义(P<0.05)。

表2 APs各证型病理特征

APs以低级别上皮内瘤变为主，高级别上皮内瘤变占比较低。各证型在上皮内瘤变程度方面，差异具有统计学意义(P<0.05)，湿瘀阻滞组(17.11%)高级别上皮内瘤变占比高于大肠湿热组(3.85%)和脾虚湿蕴组(6.17%)，差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。

2.2 APs粪便SDC2基因甲基化情况

正常对照组和APs组粪便SDC2基因甲基化阳性率分别为14.67%和56.77%，APs组粪便SDC2基因甲基化阳性率明显高于正常对照组(P<0.001)。

如表3,不同年龄分层、性别、腺瘤数量、大小和组织学类型的粪便SDC2基因甲基化阳性率无明显差异(P>0.05)。高级别上皮内瘤变(79.31%)粪便SDC2基因甲基化阳性率高于低级别瘤变(54.45%)，差异具有统计学意义(P<0.01)。

表3 APs不同临床病理类型的粪便SDC2基因甲基化情况

2.3 APs各证型粪便SDC2基因甲基化情况

如表4，APs中医各证型SDC2甲基化阳性率大小依次为湿瘀阻滞组(65.79%)>气滞血瘀组(64.00%)>大肠湿热组(51.28%)>脾虚湿蕴组(46.91%)。APs证型间粪便SDC2基因甲基化阳性率差异具有统计学意义(P<0.05)，两两比较，湿瘀阻滞组和气滞血瘀组粪便SDC2基因甲基化阳性率均明显高于脾虚湿蕴组(P<0.05)，但同大肠湿热组差异均无统计学意义(P>0.05)。

表4 APs各证型粪便SDC2基因甲基化情况

2.4 APs各证型粪便SDC2基因甲基化阳性患者病理特征

如表5，APs粪便SDC2基因甲基化阳性患者中，各证型在组织学类型方面，差异无统计学意义(P>0.05)，在上皮内瘤变方面，差异有统计学意义(P<0.05)。湿瘀阻滞组高级别上皮内瘤变占比高于大肠湿热组和脾虚湿蕴组，差异有统计学意义(P<0.05)。

表5 APs各证型粪便SDC2基因甲基化阳性患者病理特征(例)

2.5 APs中医证型与病理类型和粪便SDC2基因甲基化的相关性分析

如表6，Spearman相关性分析显示，大肠湿热证与组织学类型、上皮内瘤变和粪便SDC2基因甲基化阳性无相关性(P>0.05)。湿瘀阻滞证与绒毛状腺瘤和高级别上皮内瘤变呈正相关(P<0.05，P<0.01)，与低级别上皮内瘤变呈负相关(P<0.01)。脾虚湿蕴证与粪便SDC2基因甲基化阳性呈负相关(P<0.05)。气滞血瘀证与管状腺瘤呈负相关(P<0.05)。

表6 APs中医证型与病理类型和粪便SDC2基因甲基化的相关性分析

3 讨论

APs属中医学之“肠蕈”“便血”和“泄泻”等范畴。约70%～80%的结直肠癌由APs通过“正常黏膜—低级别上皮内瘤变—高级别上皮内瘤变—癌”途径演变而来，APs患者的结直肠癌发病率和死亡率明显高于普通人群[11]。由于腺瘤患者的临床表现错综复杂且缺乏特异性，部分结直肠癌患者在确诊时已属晚期。目前，由于缺乏微观层次的认识和辨证方法，使得APs的辨证分型纷繁复杂且与临床一致性差，因此，寻找可靠且与证候相关的生物标志物成为APs精准辨证的研究重点。作为表观遗传学的经典调控机制，DNA甲基化与中医证候的形成均受外界环境和机体遗传的共同影响，因此，甲基化的DNA有望成为辅助APs中医诊断的生物标志物。本研究将病理类型和基因甲基化特点融入APs的中医辨证分型，对中西医结合疗法在腺瘤的二级预防和结直肠癌的一级预防领域发挥“未病先防”和“既病防变”的作用具有重要的现实意义。

3.1 APs患者中医证型与病理类型具有相关性

中医认为APs为本虚标实，虚实夹杂的一种疾患。患者因饮食不节，情志内伤或起居不慎，致使脾胃功能减弱，脾胃虚则气机受阻，运化无力，津液聚而成痰湿，气虚无力推动血行，遂成瘀血，病情迁延日久则湿浊留恋，血行不利，痰、湿、瘀积聚肠道。组织学类型和上皮内瘤变程度不同，腺瘤的病位深浅和病性虚实亦有差异。本研究中，各证型的组织学类型分布存在差异，湿瘀阻滞证和气滞血瘀证中绒毛状腺瘤占比较高，原因可能是，同管状腺瘤相比，绒毛状腺瘤表面黏膜多为分叶状且易出血。本研究发现，湿瘀阻滞组中高级别上皮内瘤变占比为17.11%，明显高于脾虚湿盛证和大肠湿热证。提示，湿瘀阻滞证更易伴有高级别上皮内瘤变。原因可能是，上皮内瘤变早期多为脾虚湿盛证或大肠湿热证，患者正气亏虚不甚，尚能鼓邪外出，但随着病情迁延和瘤体增长，脏腑功能衰退，卫外抗邪功能减弱，正气无以鼓邪外出，致邪气积聚日久，气滞血凝，滋生痰浊，变生积聚，瘤体生长及癌变为湿瘀凝结和癌毒内生的结果。

3.2 甲基化的SDC2基因是APs的重要生物标志物

DNA甲基化是指以S—腺苷甲硫氨酸作为甲基供体，在DNA甲基化转移酶的作用下，DNA序列中的胞嘧啶碱基共价键结合一个甲基基团。越来越多的研究表明，肠黏膜细胞DNA序列中CpG 岛的 CpG 二核苷酸中胞嘧啶的甲基化贯穿于“腺瘤—癌序列”的整个过程[5, 12-13]。SDC2基因是转化生长因子B通路的一个关键基因，参与细胞增殖与迁移和血管生成等多种生物过程，可通过上皮间质转化和丝裂原活化蛋白激酶途径促进腺瘤的生长、癌变及转移。本研究发现，APs患者粪便SDC2基因甲基化阳性率明显高于正常对照组，提示结直肠腺瘤与SDC2甲基化相关。马晓阳等[14]在大肠癌患者、大肠腺瘤患者和正常人群粪便中发现SDC2甲基化的阳性率分别为78.1%、57.1%和2.5%。因此，SDC2可作为结直肠肿瘤的一种新的表观遗传标志物。

目前普遍认为，上皮内瘤变程度的加重是APs向癌症转化的重要步骤[15-16]。在本研究中，在高级别上皮内瘤变的SDC2甲基化阳性率为79.31%，明显高于低级别上皮内瘤变(P<0.01)。既往的研究表明，SDC2甲基化在结直肠癌中的阳性率为90.90%，在高级别上皮内瘤变中的阳性率达到了80.00%，但在正常人群中阳性率极低[17]。这提示，SDC2甲基化程度在正常肠黏膜由低级别上皮内瘤变至高级别上皮内瘤变这一过程中呈递增趋势。但是，在本研究中，管状绒毛状腺瘤和绒毛状腺瘤粪便SDC2基因甲基化阳性率与管状腺瘤相比，差异并无统计学意义。提示腺瘤患者粪便SDC2基因甲基化可能与组织学类型无关。原因可能是，粪便SDC2基因甲基化是结直肠肿瘤发生的早期事件，其发生早于组织学改变，这与马晓阳等[14]和王小军等[17]的研究结果基本一致。

3.3 APs患者中医证型与粪便SDC2基因甲基化具有相关性

中医的“证候”反映了机体的病变部位和病邪性质，不仅受年龄、地域环境及生活习惯的影响，近年来蛋白组学、代谢组学、转录组学以及基因组学研究表明，基因可以影响症候的表达。肿瘤发生、发展的分子学本质是细胞内遗传调控和表观遗传调控的紊乱，“腺瘤—癌序列”是一个多基因参与的、多阶段、多步骤改变并积累的复杂过程。基因可通过对蛋白质的表达与调控对症候表现产生不同的影响，进而影响中医辨证分型。因此研究基因微观分子水平的APs中医辨证分型特点，可以使我们了解中医证型反映疾病的病程阶段、病情轻重、预后等，为辨证分型提供客观依据。

本研究中，粪便SDC2基因甲基化阳性率在脾虚湿蕴组、大肠湿热组、气滞血瘀组和湿瘀阻滞组中分别为46.91%、51.28%、64.00%和65.79%，呈递增趋势，湿瘀阻滞组和气滞血瘀组粪便SDC2甲基化阳性率明显高于脾虚湿蕴证。提示粪便SDC2基因甲基化与“瘀血”有关。并且，在APs粪便SDC2基因甲基化阳性患者中，湿瘀阻滞组高级别上皮内瘤变占比较高，原因可能是，患者长期饮食不节，情绪不畅，随着病程进展，患者器官机能衰退，加之伴有多种慢性疾病，机体免疫调节紊乱，脾虚日久则出现肝脾肾俱虚，脾肾阳气不足，无力运化，湿浊更甚，湿浊与瘀血内结，酿生癌毒。

综上所述，APs中医证型与临床病理类型和粪便SDC2基因甲基化存在相关性，可为APs的中医微观辨证提供参考依据。但本研究为单中心研究，且绒毛状腺瘤和高级别上皮内瘤变数量偏少，样本的选择具有局限性，且中医证型易受地理环境和生活方式等因素影响，因此，下一步可扩大样本量进行多中心研究。