RasGRF1在结直肠癌细胞中的表达及其对癌细胞生物学行为的影响*

王硕，杨其贤，殷旭薇，孙颖昕

（1.江苏大学医学院，江苏镇江212013；2.南京医科大学附属常州市第二人民医院检验科，江苏常州213004）

结直肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一，发病率及病死率呈逐年上升趋势，其发生、发展机制复杂，尚未明确。目前临床治疗结直肠癌主要通过手术及放化疗，由于其恶性程度高，患者5年生存率仅为50%左右[1-2]。从基因层面探寻结直肠癌分子生物学治疗靶标以改善患者预后成为研究热点。RasGRF1是一种父系印记基因，位于人染色体25q15 上，能够调控基因表达，参与肿瘤进展[3]。何新等[4]研究显示，抑制RasGRF1 表达能够抑制人结直肠癌细胞增殖并诱导细胞凋亡。目前RasGRF1对结直肠癌细胞生物学功能影响的具体机制尚未明确。隋华等[5]研究显示，抑制PI3K/Akt 通路活化，能够抑制结直肠癌细胞增殖并诱导细胞凋亡，提高化疗敏感性。目前RasGRF1 对结直肠癌细胞生物学功能的影响是否与调控PI3K/Akt 通路有关少见报道，故本研究探究RasGRF1 在结直肠癌细胞中的表达及对癌细胞生物学行为的影响，并分析其对PI3K/Akt 通路的影响，以期为临床治疗结直肠癌提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 细胞

人结直肠癌细胞系DiFi、SNU175、HT-29、HCT-15 细胞均由广东药学院实验室保存，购自北京北纳创联生物技术研究院。

1.2 主要试剂与仪器

DMEM-H 培养基（北京伊塔生物科技有限公司），胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）（广州蕊特生物科技有限公司），Lipo-fectamineTM3000 转染试剂盒（美国Invitrogen 公司），si-RasGRF1、si-RasGRF1-NC序列均由上海生工生物工程股份有限公司合成，CCK-8 试剂盒（深圳市纽邦生物技术有限公司），Annexin V/PITC 双染试剂盒（上海复申生物科技有限公司），兔抗人Caspase-3、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt及β-actin 多克隆抗体、山羊抗兔HRP 二抗（武汉亚科因生物技术有限公司）。

二氧化碳细胞培养箱（美国Thermo 公司），C1000 型实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time polymerase chain reaction， qRT-PCR）仪（美国Bio-Rad 公司），CytoFLEX SRT 型流式细胞仪（美国贝克曼库尔特公司）。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养复苏并解冻DiFi、SNU175、HT-29、HCT-15 细胞，置于含10% 灭活FBS＋DMEM-H 的培养液，在37℃、5%二氧化碳2、95%氧培养箱中培养，每2～3 天换1 次培养液，传代培养。

1.3.2 根据RasGRF1 mRNA 相对表达量筛选细胞系分别取1.3.1 中对数生长期的各细胞，并提取总RNA、测浓度，逆转录为cDNA，进行qRTPCR 反应。总反应体系20 μL：ULtra SYBR mixture 10 μL、模板cDNA 2.0 μL、正反向引物各2.0 μL、去离子纯化水4.0 μL。反应条件：95℃变性15 s，60℃退火60 s，共40 个循环。熔解曲线：60℃至95℃，每15 秒升温0.3℃。以β-actin 为内参，采用2-ΔΔCt法计算各细胞RasGRF1 mRNA 相对表达量。qRT-PCR 引物序列见表1。

表1 引物设计

1.3.3 细胞分组及处理1.3.2 结果显示DiFi 细胞RasGRF1 mRNA 相对表达量最高，选其为研究对象。取对数生长期的DiFi 细胞，按2.5×104个/孔的密度接种于24 孔板，待细胞融合至70%～80%，更换无FBS 培养液，将细胞随机分为3 组。用无FBS 的培养液将LipofectamineTM3000 稀释并分别配制浓度为10 mmol/L 的si-RasGRF1-NC、si-RasGRF1，然后将等体积LipofectamineTM3000 分别与si-RasGRF1-NC、si-RasGRF1 混匀、静置，加入DiFi 细胞中，分别作为si-RasGRF1-NC 组（阴性对照）、si-RasGRF1 组（沉默RasGRF1 表达）。同时将未经转染的细胞设置为NG组（空白对照）。各组细胞继续培养24 h，倒置荧光显微镜下观察细胞荧光强度，每组设置6 个复孔，实验重复3 次。

1.3.4 qRT-PCR 检测RasGRF1 mRNA 的表达分别取各组DiFi 细胞并提取总RNA、测浓度，参照1.3.2 的方法，计算各组DiFi 细胞RasGRF1 mRNA 相对表达量。

1.3.5 CCK-8 法检测细胞存活情况分别取各组DiFi 细胞，胰蛋白酶消化处理，将细胞按2.5×104个/孔的密度接种于24 孔板，培养24 h 后加入CCK-8 试剂，继续培养2 h，检测490 nm 波长处各孔细胞光密度（optic density， OD）值，重复3 次，严格按照CCK-8试剂盒说明书进行操作。统计各组细胞OD 值，每组设置6 个复孔，实验重复3 次。

1.3.6 AnnexinV/PITC 双染法检测DiFi 细胞凋亡分别取各组DiFi 细胞，PBS 溶液洗涤，弃上清液，调整密度为1×106个/mL 的细胞悬液，取100 μL 加入AnnexinV/PITC（5 μL）+PI（10 μL，20 μg/mL）混匀，孵育30 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡率。每组6 个复孔，实验重复3 次。

1.3.7 Western blotting 检测细胞增殖、凋亡及PI3K/Akt 通路蛋白的表达分别取各组DiFi 细胞，以RIPA 裂解并提取总蛋白，电泳、转膜，放入5%脱脂奶粉溶液室温封闭2 h，分别加入PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Caspase-3 及内参β-actin 作为一抗（1∶500 稀释），4℃过夜，加入HRP 标记山羊抗兔二抗（1∶1 000），室温孵育1 h，显影、定影，计算目的蛋白相对表达量。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，进一步两两比较用SNK-q法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同结直肠癌细胞系中RasGRF1 mRNA 的表达

DiFi、SNU175、HT-29、HCT-15 细胞RasGRF1 mRNA 相对表达量分别为（1.00±0.15）、（0.69±0.11）、（0.73±0.12）、（0.45±0.07），经方差分析，差异有统计学意义（F=222.059，P=0.005），DiFi 细胞RasGRF1 mRNA 相对表达量最高（P＜0.05），选择DiFi 细胞进行后续实验。

2.2 各组DiFi 细胞RasGRF1 mRNA 相对表达量比较

NG 组、si-RasGRF1-NC 组、si-RasGRF1 组RasGRF1 mRNA 相对表达量分别为（1.00±0.15）、（0.99±0.16）和（0.71±0.11），经方差分析，差异有统计学意义（F=324.568，P=0.000），si-RasGRF1 组低于NG 组和si-RasGRF1-NC 组（P＜0.05），说明DiFi 细胞转染成功。

2.3 抑制RasGRF1 表达对DiFi 细胞存活能力的影响

NG 组、si-RasGRF1-NC 组、si-RasGRF1 组DiFi细胞OD 值分别为（0.87±0.15）、（0.85±0.13）和（0.37±0.06），经方差分析，差异有统计学意义（F=2 883.063，P=0.000），si-RasGRF1 组低于NG 组和si-RasGRF1-NC 组（P＜0.05）。

2.4 抑制RasGRF1表达对DiFi细胞凋亡的影响

NG 组、si-RasGRF1-NC 组、si-RasGRF1 组DiFi细胞凋亡率分别为（9.15±1.38）%、（9.03±1.36）%和（25.78±3.87）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=396.215，P=0.000），si-RasGRF1 组高于NG 组和si-RasGRF1-NC 组（P＜0.05）。见图1。

图1 各组DiFi细胞流式细胞图

2.5 抑制RasGRF1 表达对DiFi 细胞PI3K/Akt 通路蛋白的影响

NG 组、 si-RasGRF1-NC 组、 si-RasGRF1 组DiFi 细胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Caspase-3 蛋白相对表达量比较，经方差分析，差异均有统计学意义（P＜0.05）。进一步两两比较结果：si-RasGRF1组p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白相对表达量低于NG组和si-RasGRF1-NC 组（P＜0.05），Caspase-3 蛋白相对表达量高于NG 组和si-RasGRF1-NC 组（P＜0.05）。见表2和图2。

图2 各组DiFi细胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Caspase-3蛋白的表达

表2 各组DiFi细胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Caspase-3蛋白相对表达量比较 （±s）

表2 各组DiFi细胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、Caspase-3蛋白相对表达量比较 （±s）

注：†与NG组、si-RasGRF1-NC组比较，P ＜0.05。

组别NG组si-RasGRF1-NC组si-RasGRF1组F 值P 值Caspase-3 0.36±0.06 0.40±0.08 0.97±0.16†261.329 0.000 p-PI3K/PI3K 1.08±0.17 1.06±0.16 0.45±0.08†324.015 0.000 p-Akt/Akt 1.15±0.18 1.17±0.18 0.51±0.08†331.5241 0.000

3 讨论

结直肠癌是恶性程度较高的消化道肿瘤之一，发病率居全球恶性肿瘤的第三位，目前临床治疗仍以手术辅以放化疗为主，但未能取得较理想的疗效[6]。RasGRF1 是一种多结构域蛋白，能够调节肿瘤细胞生物学行为，参与肿瘤进展[7]。聂文静等[8]研究显示，RasGRF1在结直肠癌组织中异常高表达，作为促癌基因参与结直肠癌进展。文献报道，下调RasGRF1 表达能对人结直肠癌细胞增殖发挥抑制作用，对细胞凋亡发挥促进作用[4]。

肿瘤细胞增殖及凋亡失衡是肿瘤发生、发展的关键，其中Caspase-3 是凋亡过程的关键执行者[9-10]。本研究选择DiFi 细胞进行研究，成功转染DiFi 细胞，且结果显示，与NG 组、si-RasGRF1-NC 组比较，si-RasGRF1 组DiFi 细胞存活率降低，凋亡率升高。与既往研究结果一致，说明抑制RasGRF1 表达能够抑制DiFi 细胞增殖并诱导细胞凋亡。PI3K 是PI3K/Akt 信号通路的起始因子，其活化产生第二信使PIP3，进而磷酸化Akt 蛋白的Thr308位点，促使Akt 活化；而活化的Akt 发生磷酸化，最终抑制下游靶基因Caspase-3 的表达，从而抑制细胞凋亡[11-13]。马家驰等[14]研究显示，抑制PI3K/Akt 通路活化能抑制结肠癌细胞增殖及转移。既往研究显示，上调RasGRF1 表达能促进Ras-PI3K-Akt 通路活化，参与肿瘤成纤维细胞增殖及分化[15]。本研究结果显示，与NG 组、si-RasGRF1-NC 组比较，psi-RasGRF1组p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 蛋白相对表达量降低，Caspase-3 蛋白相对表达量升高，说明抑制RasGRF1表达能抑制DiFi 细胞增殖并诱导细胞凋亡，其作用可能是通过抑制PI3K/Akt 通路活化来实现的。

综上所述，RasGRF1 在人结直肠癌DiFi 细胞中异常高表达。抑制RasGRF1 表达可能抑制PI3K/Akt通路活化，从而抑制DiFi 细胞增殖并诱导细胞凋亡。然而本实验未能明确RasGRF1 对PI3K/Akt 通路的具体调控作用，后期应进行深入研究。