类孟买血型FUT1、FUT2基因突变及家系遗传分析

刘秋菊，蒋贤国

苍南县人民医院 输血科，浙江 温州 325800

目前国际输血协会（International Society of Blood Transfusion, ISBT）命名发布红细胞血型系统已有43个，除ABO、Rh血型系统外还有一个重要血型系统-H血型系统，该H抗原受控于α-1，2-岩藻糖基转移酶基因（α-1，2-fucosyltransferase,FUT1）（H）编码的α-1，2-岩藻糖转移酶的作用，另一种水溶性H抗原受控于FUT2基因（或Se）编码的α-1，2-岩藻糖转移酶的作用，当FUT1和或FUT2基因突变时，导致H抗原的全部或部分缺失，产生孟买型、类孟买型等稀有血型[1-2]。近期我们在临床上发现了1例类孟买血型，对其进行FUT1、FUT2基因测序及家系遗传分析，现将结果报告如下。

1 对象和方法

1.1 对象 先证者，男，65岁，汉族，2019年12月12日因“泡沫尿多年、血肌酐升高”就诊于苍南县人民医院，12月22日检测血型时发现血型结果凝集减弱，经先证者及家人签署知情同意书后，抽取其妻子、女儿静脉血液进行血型血清学鉴定及基因检测。本研究获苍南县人民医院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂仪器 单克隆抗-A、抗-B血型定型试剂（批号20190713）、抗-A1凝集素试剂（批号20190607）、单克隆抗-H血型定型试剂（批号20190926）均由上海血液生物医药有限责任公司提供；反定型人A、B、O型红细胞留取3人份同型供血者血液由本科室制备，当天使用；DNA提取液由北京天根生化科技有限公司提供，人类ABO血型基因分型检测试剂盒、人类H血型系统基因分型检测试剂盒（PCR-SBT法）由江苏伟禾生物科技有限公司提供，严格按试剂的说明书进行操作；电泳仪（EPS300，上海天能科技有限公司）、高速台式离心机（MICRO17，美国Thermo公司）、凝胶成像系统（Tanon-2500，上海天能科技有限公司）、PCR仪（ABI 9700，美国ABI公司）、DNA测序仪（ABI 3130，美国ABI公司），严格按照仪器说明书进行操作。

1.3 方法

1.3.1 血型血清学试验：ABO正反定型、H抗原采用试管凝集法，严格根据试剂说明书操作；吸收放散试验、ABH血型物质检测按照《全国临床检验操作规程》。判断标准：红细胞与抗-H血清不凝集者为类孟买型，否则为非类孟买型。

1.3.2 DNA提取：采用DNA提取液对其进行DNA结合和纯化，核酸样本ODA260/A280：1.6～2.0，采用磁珠法。

1.3.3 ABO基因测序：严格按人类ABO血型基因分型检测试剂盒说明书操作，根据Gene Bank提供ABO基因序列信息（NG_006669.1）设计ABO基因第1至第7外显子扩增引物，引物同扩增测序引物。对样本ABO基因外显子进行E6E7 PCR扩增后，采用2.5%琼脂糖凝胶对其进行扩增产物的鉴定，产物条带确定后根据其亮度，进行其基因测序；测序采用Sanger法。

1.3.4FUT1、FUT2基因测序：严格按照人类H血型系统基因分型检测试剂盒说明书操作，PCR扩增条件：95 ℃变性2 min，93 ℃变性35 s、60 ℃退火40 s、72 ℃延伸1.5 min，循环36次，最后72 ℃延伸10 min，冷却到4 ℃。采用Sanger法测序。

1.3.5 结果判定基因型：采用Chromas Version 2.6.5软件阅读测序图谱，与ABO*A1.01序列 （GeneBank序列号NG006669.1）比较确定其突变位点，根据ISBT网站提供的Names for ABO（ISBT001）blood group alleles v1.1 171023数据库，综合结果判定其ABO基因型；根据ISBT提供的Names for H（ISBT 018）Blood Group Alleles文件以综合结果判定（以FUT1、FUT2为参考序列）。全部委托江苏伟禾生物科技有限公司进行技术测序服务。

2 结果

2.1 血清学结果 先证者正定型A抗原凝集1+、其女儿正定型O型，反定型均为A型，通过吸收放散试验证实红细胞上存在A抗原，唾液和凝集抑制试验提示先证者分泌型，A和H物质阳性，结合血清学检测结果推测血型为Amh型；其妻子血清学检测为A型，非类孟买型。见表1。

表1 先证者及家系ABO血型血清学检测结果

2.2 ABO基因测序 先证者、妻子及女儿基因型均为ABO*A1.02/O.01.02。

2.3FUT1、FUT2基因测序 先证者及女儿FUT1：c.551-552delAG（见图1）、FUT2：c.357C＞T、c.385A＞T（见图2）。

图1 先证者和女儿FUT1基因测序结果（c.551-552delAG）

图2 先证者和女儿FUT2基因测序结果

3 讨论

类孟买血型是一种罕见红细胞表型，发生率低，红细胞上缺乏H抗原。文献报道其既具有明显遗传异质性，又有一定的分布区域性，在日本、泰国及中国的台湾、福建、香港、北京、云南拉祜族人群的频率分别为1～2/300 000、1/5 000、1/8 000、1/8 500、1/15 620、1/102万、2.2%[1，3]。随着分子技术的发展，孟买、类孟买血型抗原合成、分泌以及表达等机制逐步深入[2，4-5]。H抗原缺失的分子研究基础由FUT1基因突变引起[6-8]。根据dbRBCBGMT发布的数据和相关文献报道[9]，目前已发现60多种FUT1基因，基因异常包含缺失、插入突变和错义突变等，且大部分都是错义突变。

KELLY等[10]在1994年第一次报道孟买、类孟买血型的分子机制。据统计报道[1]，与红细胞H抗原缺陷相关FUT1最常见变异为FUT1*01N.06（c.551_552delAG）、FUT1*01N.13（c.881_882delTT）和FUT1*01W.09（c.658C＞T）；FUT2等位基因以FUT2*01和FUT2*09基因存在，以c.357C＞T与c.716 G＞A变异；类孟买血型基因缺陷FUT1基因和正常或表达弱FUT2基因，其H抗原强弱决定变异型α-1，2-岩藻糖转移酶活性强弱，反应其红细胞（或不）与抗A抗B抗体发生凝集现象，或其通过吸收放散试验检测出A或B抗原，但也有报道不能检出[11]。国内相关文献[12-13]报道类孟买血型最常见单体型为547-552delAG，其导致的移码变异引起氨基酸多肽链提前终止在268位，最终使α-1，2-岩藻糖基转移酶失去活性不能合成H抗原。本例先证者血清学发现血型结果凝集减弱，H抗原阴性，红细胞吸收放散试验检出A抗原，ABO基因分型A02，通过基因测序发现FUT1c.551-552delAG，导致p.Glu184Valfs*85突变，FUT2c.357C＞和c.385A＞T突变，该突变在参考数据库中虽尚未公布，但文献中偶有报道含c.357C＞T、c.385A＞T位点个体为分泌型。本研究的基因分型与血清学两者结果相互验证确认先证者为类孟买血型，其妻子为正常的O型，女儿血型同先证者，根据家系分析先证者的血型及基因突变遗传给其女儿。

类孟买血型确认目前主要依据血型血清学实验，其血清学特点：红细胞上有弱A、B抗原，可通过吸收放散实验检出，与抗-H试剂不凝集反应，部分有抗-H、抗-HI或两者皆有的抗体。为防止类孟买血型漏检，在平常疑难血型鉴定中可增加抗-H血型试剂使用，输血首选自体输血或同型输血，如无血源，切实考虑抗-A、抗-B和抗-HI是否存在，可选择37 ℃与供血者无反应的ABO同型红细胞输注，最大限度减少溶血存在的风险，如紧急抢救没有同型血液需要输注O型悬浮红细胞时，采用盐水法和抗人球蛋白法配血均相合血液，以防止抗-H引起输血反应[14]。先进的分子生物学技术有助于帮助类孟买型患者准确鉴定血型，能够佐证补充血清学检验结果，家系成员结果分析对该类患者遗传机制及后续精准输血具有重要的临床意义[15]。