川陈皮素通过Rnd3调控核因子κB信号在心肌梗死中的作用机制研究Δ

余继全，阮 鹏，葛建军

(中国科学技术大学附属第一医院心脏大血管外科，合肥 230001)

心肌梗死指心肌的缺血性坏死，是在冠状动脉病变的基础上，冠状动脉的血流急剧减少或中断，冠状动脉阻塞导致血管覆盖区域缺血坏死，最终导致多达10亿心肌细胞的死亡[1]。因为凋亡信号与梗死心脏的修复和重构有关，因此，靶向凋亡信号有可能通过减弱梗死心脏的扩张性重构而发挥有益的作用[2]。此外，研究结果表明，凋亡信号在细胞保护和再生中发挥着巨大作用，再次激发了人们对该领域的兴趣[3]。川陈皮素是一种碳水化合物，是新陈代谢的硫化促进剂，具备一定的抗红细胞凝结的功效，因此，在抗血栓产生层面，其在防癌和抑菌方面具备抗敏和抗炎的作用，常被用于治疗癫痫病和过敏等病症[4]。有研究结果发现，川陈皮素在防止心血管疾病层面也有一定的作用，如其对心肌缺血再灌注损伤具有治疗作用[5]。Rnd3最初被定义为Rho蛋白激酶1的抑制因子[6]。此前对Rnd3的研究主要集中于Rho激酶介导的生物学功能的抑制作用，包括肌球蛋白轻链磷酸化、肌动蛋白细胞骨架形成和凋亡等[7]。Rnd3与室管膜细胞增殖相关[8]。然而，其在心肌梗死凋亡中的作用尚不清楚。核因子κB(NF-κB)P65复合物在发育和成熟的神经系统中广泛表达，并且激活细胞增殖相关基因的表达，保护细胞免受凋亡[9]。虽然NF-κB参与了神经元凋亡率的降低，但其在心肌梗死中的潜在分子机制和功能尚不清楚。由于Rnd3和NF-κB都与细胞凋亡过程息息相关，探索两者在心肌细胞凋亡过程中的作用对于心肌梗死的治疗具有重要指导意义。

1 材料

1.1 实验动物

8周龄雄性C57BL/6小鼠，体重约为25 g；8周龄雌性妊娠SD大鼠，体重约为280 g。购于中国科学院上海实验动物繁殖中心，饲养于SPF级动物房中，饲养期间给予常规饮水、喂食。本研究通过我院动物伦理委员会审批。

1.2 仪器

311型细胞培养箱(美国Thermo公司)；HH-2型数显恒温水浴锅(江苏杰瑞尔电器有限公司)；CJV1500-Y标准型洁净工作台(山东新华医疗器械股份有限公司)；Universal 320/320R型低温离心机(美国Sigma公司)；SX-300型高压蒸汽灭菌锅(日本Tomy Digital Biology公司)；小型垂直电泳转印系统(美国Bio-rad公司)；Sigma Vet小鼠心脏超声系统(上海玉研科学仪器有限公司)；Axio Vert.A1倒置光学显微镜(德国Zeiss公司)。

1.3 药品与试剂

川陈皮素(西安展迅生物科技有限公司)；Protein A琼脂糖珠(美国Sigma公司)；Rnd3抗体(武汉爱博泰克生物科技有限公司)；Caspase3抗体(武汉爱博泰克生物科技有限公司)；GAPDH抗体(武汉爱博泰克生物科技有限公司)；P65抗体(武汉爱博泰克生物科技有限公司)；免疫球蛋白G(IgG)抗体(武汉爱博泰克生物科技有限公司)；辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG抗体(美国Jackson公司)；NF-κB激动剂(美国Selleck公司)；抑制Rnd3慢病毒(Sh-Rnd3)和过表达Rnd3慢病毒(OE-Rnd3)及对照[汉恒生物科技(上海)有限公司]；Sh-Rnd3 AAV9病毒及对照[汉恒生物科技(上海)有限公司]。

2 方法

2.1 小鼠心肌梗死模型

根据参考文献[1]对小鼠进行心肌梗死造模。以3%戊巴比妥钠80 mg/kg腹腔注射麻醉，用小鼠剃毛器剃除小鼠胸部及腋下毛发(充分暴露手术区)，以碘酒和75%乙醇进行手术区消毒。麻醉后，打开外置光源、显微镜开关，打开呼吸机，设置好各参数(呼吸频率为110 次/min)，将气管插管沿声门插入气管，取下小鼠接上呼吸机。小鼠采用右侧卧位，用眼科剪在左前肢腋下，用显微剪于三、四肋间打开胸腔充分暴露心脏，用显微直镊轻轻夹起少量心包并于左心耳下撕开少许心包，充分暴露左冠状动脉前降支或所在区域。于显微镜下找到左冠状动脉前降支走向或可能所在位置，持针器持取7-0带针缝合线，于左心耳下缘2 mm处进针，缝线穿过左冠状动脉前降支，以完全阻断左冠状动脉前降支血流。结扎完成后，以6-0缝线完全缝合胸腔开口，关闭胸腔，由内向外逐层缝合各层肌肉和皮肤。待小鼠自然苏醒后，将小鼠从呼吸机上取下并取下气管插管，正常饲养。4周后进行心脏超声检测。

2.2 动物分组及处理

2.2.1 普通正常小鼠实验：取普通正常小鼠40只，随机分为四组，每组10只。假手术组为普通正常小鼠打开胸腔后立即缝合不进行结扎左冠状动脉前降支；心肌梗死手术组为普通正常小鼠打开胸腔后结扎左冠状动脉前降支然后进行缝合；川陈皮素灌胃组为普通正常小鼠灌胃20 mg/kg川陈皮素[2]；川陈皮素灌胃+心肌梗死手术组为普通正常小鼠先灌胃20 mg/kg川陈皮素，3周后对小鼠进行心肌梗死手术。4周后处死上述小鼠结束实验。

2.2.2 心肌梗死小鼠实验：取模型小鼠(心肌梗死手术)40只，并随机分为四组，每组10只。造模组为普通小鼠进行心肌梗死手术；造模+川陈皮素组为模型小鼠灌胃川陈皮素20 mg/kg；造模+NF-κB激动剂组为模型小鼠心肌层注射NF-κB激动剂100 nmol/L；造模+川陈皮素+NF-κB激动剂组：模型小鼠灌胃20 mg/kg川陈皮素和心肌层注射NF-κB 激动剂100 nmol/L。4周后处死以上小鼠结束实验。

2.3 小鼠心肌层注射

将小鼠放在手术台上固定好，使用4%水合氯醛麻醉后，退去小鼠颈部和左胸口的毛发，并用75%酒精消毒，使用手术剪在小鼠左胸口横向剪开一约1 cm长的开口，暴露出心脏。使用微量注射器按三点注射的方式注射NF-κB激动剂100 nmol/L进左心室室壁，对照组小鼠注射等量PBS。注射结束后立刻缝合肌肉和皮肤，并对伤口进行消毒。待小鼠完全苏醒后将其放回鼠笼继续饲养。

2.4 大鼠心肌细胞实验

2.4.1 分离新生大鼠心肌细胞(NRCM)：取SD大鼠新生小鼠心脏，将残存血液挤净后放入缓冲液中，用剪刀将心脏组织剪成匀浆状，按照1只心脏加入胰酶和胶原酶各500 μL依次消化，加入等量的马血清进行终止，将得到的细胞悬液依次通过一次性过滤网筛选，去除杂质，采用差速贴壁法得到纯的心肌细胞，弃除未贴壁的成纤维细胞。按照所需细胞密度进行铺板实验。

2.4.2 蛋白免疫共沉淀：收集细胞入1.5 mL EP管中，4 ℃，14 000 r/min离心15 min并用预冷的PBS洗涤细胞2次，每1 mL总蛋白中加入Protein A琼脂糖珠(50%)100 μL，4 ℃摇晃10 min，以去除非特异性杂蛋白，降低背景。4 ℃，14 000 r/min离心15 min，将上清转移到一个新的离心管中，去除Protein A珠子。Bradford法做蛋白标准曲线，测定蛋白浓度。用PBS将总蛋白稀释到约1 μg/μL。加入一定体积的兔抗到500 μL总蛋白中，4 ℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜。加入Protein A琼脂糖珠100 μL来捕捉抗原抗体复合物，4 ℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜。14 000 r/min瞬时离心5 s，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清液，用预冷的RIPA buffer洗3遍，每遍800 μL。用60 μL 2×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，轻轻混匀，上样前样品煮5 min后进行蛋白质印迹法实验。

2.4.3 细胞转染慢病毒：慢病毒转染前24 h，将贴壁细胞以1×105/孔铺到24孔板中。使细胞在慢病毒转染时的数量为2×105/孔左右。第2日，用含有6 μg/mL polybrene的新鲜培养基2 mL替换原培养基，加入适量病毒悬液。37 ℃孵育。4 h后加入新鲜培养基2 mL以稀释polybrene，继续培养72 h，72 h后结束实验。

2.4.4 染色质免疫共沉淀：首先使用3%的甲醛交联细胞10 min，然后加入Glycine 1.5 mmol/L终止交联反应。依次使用细胞裂解液和核裂解液各1 mL裂解细胞膜和细胞核，使用200 Hz的超声将细胞核中的DNA片段剪切到250 bp左右。将超声后的DNA片段离心后取上清液，与5 μg抗体孵育过夜，对应种属的IgG作为阴性对照。提取DNA进行荧光定量PCR检测。

2.5 蛋白质印迹法实验

配制10%的SDS-PAGE浓缩胶和分离胶。加入1 mL蛋白裂解液入含有组织块的EP管中以裂解组织提取蛋白，采用BCA法测定定量蛋白浓度，浓缩胶中每孔加入蛋白样品20 ng/μL，浓缩胶用80 V电压进行电泳，待样品进入分离胶后，改用120 V进行电泳。跑胶完成以后，将胶上无样品的多余部分切除，润湿滤纸和海绵，提前10 min用转膜 Buffer润洗PVDF膜。分离的多肽转移至PVDF膜上，转膜结束后用5%的脱脂牛奶室温(25 ℃)封闭2 h。一抗孵育过夜，Caspase3(1∶1 000)，Rnd3(1∶1 000)，GAPDH(1∶1 000)。次日，用TBST洗膜3次，1次10 min。室温下用二抗孵育2 h。用TBST洗膜3次，1次10 min。用ECL显影液进行显影曝光。

2.6 Tunel染色

将冰冻切片从-80 ℃冰箱中取出并在室温复温5 min，用PBS轻柔漂洗3次，1次5 min。用4%多聚甲醛室温固定15 min，用Proteinase K工作液在37 ℃中处理组织15 min，用PBS轻柔漂洗3次，1次5 min，每块组织覆盖50 μL TdT+450 μL荧光素标记的dUTP混合液，于37 ℃湿暗盒中反应30 min，用PBS轻柔漂洗3次，1次5 min。用DAPI避光处理15 min，用PBS轻柔漂洗3次，1次5 min。使用荧光显微镜进行拍摄统计。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 川陈皮素抑制心肌梗死小鼠心脏组织中Rnd3和凋亡蛋白的表达

心脏超声结果显示，与假手术组相比，心肌梗死手术组小鼠心脏射血分数和短轴缩短率明显降低；与心肌梗死手术组相比，川陈皮素灌胃+心肌梗死手术组小鼠心脏射血分数和短轴缩短率明显升高，上述差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1(A)。蛋白质印迹法实验结果显示，与假手术组相比，心肌梗死手术组小鼠心脏组织中Rnd3和Cleaved-caspase3的含量显著升高；与心肌梗死手术组相比，川陈皮素灌胃+心肌梗死手术组小鼠心脏组织中Rnd3和Cleaved-caspase3的含量显著降低，上述差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1(B)。

A.川陈皮素对小鼠心脏射血分数和短轴缩短率的影响；B.川陈皮素对小鼠心脏组织凋亡蛋白Cleaved-caspase3和Rnd3表达的影响；“*”表示P<0.05

3.2 Rnd3通过结合NF-κB P65调控心肌梗死

应用蛋白免疫共沉淀实验检测Rnd3和P65的结合情况，结果显示，与IgG组相比，Rnd3蛋白和P65蛋白存在结合，见图2(A)；应用染色质免疫共沉淀实验检测Rnd3和P65的结合情况，结果显示，与IgG组相比，Rnd3 mRNA和P65 mRNA存在结合，见图2(B)；应用蛋白质印迹法实验检测NRCM细胞中转染Sh-Rnd3，P65蛋白表达升高，见图2(C)；应用蛋白质印迹法实验检测NRCM细胞中转染OE-Rnd3，P65蛋白表达降低，见图2(D)。

A.Rnd3与NF-κB P65蛋白的结合情况；B.Rnd3与P65 mRNA的启动子区域的结合情况；C.转染Sh-Rnd3，P65蛋白表达情况；D.转染OE-Rnd3，P65蛋白表达情况；“*”表示P<0.05

3.3 川陈皮素激活NF-κB信号通路保护心肌梗死导致的细胞凋亡

心脏超声结果显示，与造模组相比，造模+川陈皮素组、造模+NF-κB激动剂组和造模+川陈皮素+NF-κB激动剂组小鼠心脏射血分数和短轴缩短率升高，差异均有统计学意义(P<0.05)，但川陈皮素、NF-κB激动剂同时给药不存在叠加效应，见图3(A)。蛋白质印迹法实验结果显示，与造模组相比，造模+川陈皮素组、造模+NF-κB激动剂组和造模+川陈皮素+NF-κB激动剂组小鼠Cleaved-caspase3表达降低，差异均有统计学意义(P<0.05)，川陈皮素、NF-κB激动剂同时给药存在叠加效应，见图3(B)。Tunel染色实验结果显示，与造模组相比，造模+川陈皮素组、造模+NF-κB激动剂组和造模+川陈皮素+NF-κB激动剂组小鼠细胞凋亡减少，差异均有统计学意义(P<0.05)，两者同时给药存在叠加效应，见图3(C)。

4 讨论

心肌梗死指在冠状动脉病变的基础上，如发生冠状动脉粥样硬化，脂性斑块发生脱落，进而堵塞相应部分的冠状动脉，发生冠状动脉供血急剧减少或者中断，进而使冠状动脉供应部位的心肌发生急性和持久性的缺血，进一步会导致心肌坏死[10]。心肌梗死往往会表现为持久的胸骨后剧烈疼痛、发热、白细胞计数升高以及血清标志物水平升高，尤其是心肌坏死标志物的增加[11]。心肌梗死还可诱发一系列心律失常和休克等[12]。近年来，随着心肌梗死患病人数的急剧增长，越来越多的研究聚焦于心肌梗死的防治手段。目前，临床上常采用抗炎、降脂、镇痛的药物和再灌注进行治疗，但适用性和治疗效果有一定局限性[13]。此外，缺血再灌注治疗会使遭受一定时间缺血的组织细胞恢复血流后引起组织损伤程度迅速加剧的现象，对患者造成二次损伤[14]。

心肌细胞凋亡是心肌梗死发生发展过程中心肌收缩单元持续丧失的主要原因，与心功能进行性降低有关，参与心肌梗死的基本病理生理过程[15]。抑制心肌缺血后心肌细胞凋亡，增加心肌细胞存活数量，有利于预防和治疗心肌缺血，还可促进心功能恢复，有利于患者的长期预后。因此，抑制心肌细胞凋亡对减少心脏重构、改善心功能具有重要的临床意义。

心肌梗死过程涉及多条信号通路的调控，磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信号转导通路是防止心肌缺血再灌注损伤的重要通路，缺血性预处理或活性药物刺激可以激活PI3K/AKT信号通路，该信号通路的激活参与调控心肌细胞增殖和凋亡，且可促进心肌梗死后的血管生成，保护心脏[16-17]。NF-κB是生物体内一种重要的转录因子，抑制NF-κB可以减轻炎症反应，激活NF-κB可促进血管形成和迁移，且NF-κB的表达水平可作为预测急性心肌梗死患者病情严重程度和预后的重要指标[18-19]。

川陈皮素作为抗血栓药，在疏通血管、抑制血小板聚集方面可发挥重要作用[20]。另有文献报道，Rnd3可通过RhoA-ROCK1和ERK1/2信号通路抑制细胞增殖和迁移、促进细胞凋亡[21]。本研究结果发现，在心肌梗死小鼠心脏组织中凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3表达明显升高，表明心肌梗死过程中确实凋亡作用增强；且心肌细胞中Rnd3表达升高，但在灌胃川陈皮素治疗后，凋亡相关蛋白Cleaved-caspase3和Rnd3表达显著降低；同时，Tunel染色发现，凋亡细胞数目也减少，进一步证实川陈皮素可以通过下调Rnd3水平抑制心肌梗死导致的心肌细胞凋亡，其对心肌梗死具有保护作用。

抑制Rnd3/NF-κB通路可减轻小鼠肝脏缺血再灌注损伤。Rnd3为Ras超家族的重要成员，为NF-κB通路相关的负调控因子，Rnd3蛋白可下调p65蛋白表达，降低TNF-α和IL-6水平，从而减轻肝脏缺血/再灌注损伤[22]。本研究结果显示，Rnd3通过与NF-κB P65结合抑制心肌梗死细胞凋亡，对急性心肌梗死有保护作用。

综上所述，川陈皮素/Rnd3/NF-κB P65通路可能为心肌梗死的机制提供新的认识。