不同细菌学与病理学检查技术对骨关节结核诊断的效能研究

苏丹 车南颖 欧喜超 赵颖丽 李琨 陈学敬 林海峰 穆晶 黄海荣

病理学检查是细菌学检查之外最重要的结核病确诊途径。近年来，超声或CT引导下的针吸活检技术由于微创、精准、便利、低风险等特点逐步得到普及，使得病理学检查在疾病诊断和鉴别诊断中发挥日益重要的价值。我国肺外结核患者约占全部结核病患者的10%～20%，骨关节结核占全部结核病的3%～5%，占肺外结核的15%[1]。骨关节结核若延误治疗，则会导致截瘫、脊柱后凸畸形等严重并发症，严重危害患者生命及生活质量[2]。早期诊断、早期治疗是控制骨关节结核的关键。对骨关节结核患者组织标本和脓液标本开展分子生物学检测，改变了过去骨关节结核细菌学诊断阳性率低的局面，同时还能及时提供结核分枝杆菌的药物敏感性试验结果，促进诊断和治疗精准程度的提高[3]。本研究以临床疑似骨关节结核患者为研究对象，回顾性分析了多种细菌学和病理学检测技术诊断骨关节结核的检测效能，探讨分子生物学技术在骨关节结核诊断中的应用价值。

对象和方法

一、研究对象

收集2016 年1月至2018 年12月在首都医科大学附属北京胸科医院住院治疗的213例疑似骨关节结核患者为研究对象。患者纳入情况及各项检测开展情况见图1。213例纳入患者中，男性152例，占71.4%(152/213)，女性61例，占28.6%(61/213)；汉族患者占87.3%(186/213)；15～64岁患者占85.4%(182/213)，<15岁患者占2.8%(6/213)，≥65岁患者占11.7%(25/213)。本研究方案通过首都医科大学附属北京胸科医院伦理委员会批准(伦理审批编号：BJXK-2016-05)。

图1 患者纳入及各项检查开展情况

二、诊断标准

根据骨结核综合参考标准(composite reference standard, CRS)[4]与《中国结核病病理学诊断专家共识》[5]，将疑似骨关节结核患者分为以下4类：确诊骨关节结核患者(结核分枝杆菌培养阳性)、临床诊断骨关节结核患者(结核分枝杆菌培养阴性、活检或手术标本病理显示为干酪样肉芽肿，并且对抗结核治疗反应良好)、疑似骨关节结核患者(没有细菌学及病理学证据，但是对抗结核治疗反应良好，影像学符合骨关节结核)、非结核患者(没有细菌学等其他结核方面证据并且抗结核治疗无效)。

根据细菌学和病理学检测结果，将疑似骨关节结核患者分为以下四类： 确诊骨关节结核患者：骨标本涂片和(或)阳性，或者病理抗酸染色阳性；上述检查均阴性，但同期伴肺部疾病痰标本检测涂片和(或)培养和(或)分子检测结果阳性，同时骨病理检查肉芽肿性病变。高度疑似骨关节结核患者：骨标本涂片、培养均阴性，骨标本病理典型的肉芽肿伴或不伴坏死。疑似骨关节结核患者： 骨标本涂片、培养均阴性，骨标本病理检测不典型的肉芽肿，伴或不伴坏死。排除结核患者：骨标本涂片、培养均阴性，骨标本病理检测无肉芽肿病变，临床不考虑为结核，或是通过其他检查排除结核。

纳入标准：(1)在骨科进行手术的疑似骨关节结核患者；(2)患者手术标本同时送检细菌学和病理学检查；(3)送检病理检查的组织标本和送检细菌学检查的脓液标本来自相同手术部位。

数据采集：收集按照研究纳入标准纳入患者的脓液标本涂片镜检、BACTEC MGIT 960液体培养(MGIT 960培养)、实时荧光定量PCR(FQ-PCR)检测、GeneXpert MTB/RIF(Xpert)检测结果，以及组织标本抗酸杆菌染色和FQ-PCR检测结果。

三、研究方法

1．标本处理：脓液标本采用N-乙酰-L半胱氨酸(NALC)-氢氧化钠法进行处理。所有组织标本均经4%中性甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋。

2. 脓液标本涂片检查：遵照《结核病实验室检验规程》[6]中的标准化操作程序执行。

3．脓液标本MGIT 960培养：加入0.5 ml处理后的脓液标本至MGIT 960培养管(含0.8 ml OADC营养添加剂和抑菌剂)，然后将培养管放入MGIT 960全自动培养系统(美国BD公司)中进行培养，实时监测并读取结果。以结核分枝杆菌标准株H37Rv作为阳性对照，以空白管作为阴性对照。

4. 脓液标本Xpert检测：将Xpert MTB/RIF试剂盒配套的处理液加入到含有NALC-NaOH处理后脓液标本的离心管中，涡旋振荡后静置15 min，将处理后样品由加样孔缓慢加入到反应盒内，然后上机，反应2 h后读取结果[7]。

5. 脓液标本FQ-PCR检测：采用达安基因公司生产的结核分枝杆菌PCR检测试剂盒，阳性对照和阴性对照设置及其他具体操作见产品说明书。

6. 组织标本抗酸染色：抗酸染色试剂盒(BA-4090B)购自珠海贝索生物技术有限公司。石蜡切片厚4 μm，常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇(高浓度到低浓度)后入水；石碳酸复红染色1 h，水洗后盐酸乙醇分化数秒至无红色，再水洗；亚甲蓝染色20 s，水洗；梯度乙醇脱水，二甲苯透明后，中性胶封片，油镜下观察。结果判定：观察见到红色杆状、略弯曲、串珠状抗酸杆菌为抗酸染色阳性。

7. 组织标本FQ-PCR检测：石蜡包埋组织标本的DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司(北京)，DNA提取按照试剂盒操作说明书进行。结核分枝杆菌核酸测定试剂盒(荧光PCR法)购自上海之江生物科技股份有限公司，具体操作见产品说明书。

四、统计学处理

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计学分析，采用四格表的形式计算敏感度和特异度，根据CRS，评价不同检测技术对骨关节结核的检测效能。各种检测方法的检出率采用配对卡方检验(McNemar test)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、细菌学联合病理学检查对患者的检出情况

依据CRS，213例纳入患者中，186例患者诊断为骨关节结核，27例患者排除骨关节结核。186例骨关节结核患者中，脊柱结核患者占64.0%(119/186)，外周骨关节结核患者占36.0%(67/186)。27例排除骨关节结核患者包括非结核性滑膜炎2例、葡萄球菌感染3例、金黄色葡萄球菌感染2例、布鲁杆菌病3例、真菌感染伴陈旧性肺结核1例、胞内分枝杆菌感染1例，其余15例未获得明确的临床诊断，但均排除结核病。

依照细菌学和病理学联合分类标准，186例骨关节结核患者中，124例为确诊结核患者，23例为高度疑似患者，39例为疑似患者。不同类别的患者在疾病发生部位间差异均无统计学意义(P值均>0.05)。见表1。

表1 不同患病部位在不同分类患者中的分布情况 [例数(构成比，%)]

二、不同检测方法在骨关节结核诊断中的检测效能

在213例疑似骨关节结核患者中，分别以开展相应检查的纳入患者作为分析对象，根据CRS结果，脓液标本涂片镜检、MGIT 960液体培养、FQ-PCR、Xpert以及组织标本抗酸杆菌染色和FQ-PCR检测的敏感度分别为28.7% (49/171)、49.0% (48/98)、58.1% (25/43)、87.5% (161/184)、48.6%(90/185)和85.4%(146/171)；特异度分别为100.0% (26/26)、11/11、8/9、96.2%(25/26)、96.3% (26/27)和100.0% (27/27)，见表2。

表2 不同检测方法在骨关节结核患者中的检测效能

对124例确诊骨关节结核患者不同类型检查的结果分析发现，脓液标本涂片镜检、MGIT 960液体培养、FQ-PCR、Xpert检测以及组织标本抗酸染色和FQ-PCR检测骨关节结核的敏感度分别为42.2% (49/116)、62.3% (48/77)、60.0% (18/30)、95.1% (117/123)、72.4% (89/123)和92.9% (105/113)。

23例高度疑似骨关节结核患者不同类型检查的结果分析发现，脓液标本FQ-PCR、Xpert检测以及组织标本FQ-PCR检测的敏感度分别为3/5、77.3% (17/22)和77.3% (17/22)。39例疑似骨关节结核患者中，脓液标本FQ-PCR、Xpert检测以及组织标本FQ-PCR检测的敏感度分别为4/8、69.2% (27/39)和72.9% (27/37)。

脓液标本FQ-PCR检测在不同分类骨关节结核患者中的敏感度差异无统计学意义(χ2=0.513，P=0.888)；脓液标本Xpert检测在确诊骨关节结核患者中的检测敏感度明显高于高度疑似和疑似骨关节结核患者(χ2=19.331，P=0.000)；组织标本FQ-PCR检测在确诊骨关节结核患者中的检测敏感度明显高于高度疑似和疑似骨关节结核患者(χ2=10.037，P=0.005)。

三、 Xpert在不同部位骨关节结核患者中检测利福平耐药情况

在186例确诊骨关节结核患者中，184例患者进行了Xpert检测，其中23例结核分枝杆菌检测结果为阴性，161例结核分枝杆菌检测结果为阳性。11例结核分枝杆菌检测阳性患者为利福平耐药，利福平耐药率为6.8%(11/161)，其中腰椎结核患者6例，胸椎与外周骨关节结核患者各2例，四肢骨关节结核患者1例。

讨 论

骨关节结核如能早诊断、早治疗，不仅可以尽快控制疾病进展、缩短疗程，还可减轻患者经济负担，避免或减少后遗症的发生。传统骨关节结核的诊断主要依赖细菌学检查，主要包括抗酸染色涂片镜检和分枝杆菌培养等检测技术。结核分枝杆菌培养阳性被认为是结核病诊断的“金标准”，同时获得阳性培养物还能为后续开展药物敏感性试验和菌种鉴定等提供检测对象。结核病病灶中的氧分压对结核分枝杆菌分裂繁殖的速度有重要影响，当病灶中氧分压高时细菌分裂繁殖快。骨关节结核病灶中的氧分压远比肺结核病灶低，因此，造成骨关节结核病灶中荷菌量相对较低，影响了各种细菌学检查的阳性率。同时，结核分枝杆菌在中性环境中有利于分裂繁殖，而骨关节结核的寒性脓肿为偏碱性的微环境，不利于结核分枝杆菌生长，进一步减少了骨关节结核病灶中的荷菌量[2]。国内外研究表明，骨关节结核脓液或病灶中结核分枝杆菌改良罗氏培养阳性率为25%～71.15%，阳性结果报告时间为30 d左右[8-9]； MGIT 960 液体培养阳性率可达56.90%～83.87%，报告时间为11 d左右[10]。近些年，分子诊断技术在骨关节结核细菌学诊断中逐渐发挥着越来越重要的作用，明显提高了骨关节结核患者的病原学阳性检出率[11-12]，并且能够在检测当天或几天内获得一线抗结核药物的药物敏感性结果，有助于对耐药结核病患者尽快制定合理的个体化治疗方案。传统的骨关节结核病理学诊断是通过大体和镜下观察病灶组织的形态学改变来获得诊断结果[13-14]。通常结核性病变典型者表现为上皮样细胞(epithelioid cell)聚集形成肉芽肿结节，中央可见均质红染的干酪样坏死，外周可见朗格汉斯(Langhans)巨细胞，可伴或不伴有抗酸杆菌检查阳性。本研究结果显示，通过对组织标本开展分子生物学检测能够进一步优化骨关节结核和耐药骨关节结核的诊断技术选择。

本研究发现脓液标本 Xpert 检测和组织标本FQ-PCR 检测均获得比较高的敏感度，二者之间差异无统计学意义。分子诊断普遍具有检测时间短的优势，有利于尽快诊断骨关节结核，减少诊断延误。关于肺结核的研究显示， Xpert检测较其他检测技术表现出更高的敏感度[15]。但在本研究中组织标本 FQ-PCR检测获得与脓液标本Xpert 检测接近的敏感度，可能主要是因为组织标本FQ-PCR检测通常在组织病理学发现有结核肉芽肿病变后才从病灶部位取材进行检测，因此，本研究中获得的组织标本 FQ-PCR 阳性检出率要远高于脓液标本的 FQ-PCR 检测结果。另外，对于发现肉芽肿的组织标本可优先考虑价格更为便宜的FQ-PCR技术进行结核病的确诊。

在确诊骨关节结核患者中，骨关节结核组织标本进行FQ-PCR 检测的敏感度要高于抗酸染色法(分别为92.9%和72.4%)。与抗酸染色方法相比，FQ-PCR 检测在组织标本荷菌量较少时仍可获得比较理想的阳性检出率，从而明显提高病理学诊断结核病患者的病原学阳性率。过去病理诊断除了细胞形态学观察，通常仅开展组织抗酸染色，以进一步诊断结核。从本研究中的病理抗酸染色方法中能够看出，即便显微镜下呈现典型的肉芽肿病变，抗酸染色检出率仍然不高，主要原因就是因为抗酸染色镜检技术本身敏感度低，由此提示对组织标本常规开展分子检查非常有必要。

本研究中Xpert和FQ-PCR分别在依据CRS排除结核的患者中获得1例阳性结果，分子生物学检测技术在临床应用过程中，可能会由于患者曾经感染结核分枝杆菌或者实验室污染等原因，出现假阳性的结果。因此，在分子生物学检测技术时，要考虑有假阳性的可能，避免误判。此外，本研究中所用参考标准是骨结核综合参考标准，这一标准并未充分考虑非结核分枝杆菌(NTM)的影响，因此对于抗酸杆菌阳性、培养未做进一步鉴定时，有可能会将NTM肺病误判为结核病。然而，本研究中涂片阳性和(或)培养阳性的患者，通常Xpert和FQ-PCR检测结果也为阳性，表明本研究纳入的患者由NTM感染引起的可能性比较低。由于本研究纳入患者主要来自北方地区，属于NTM感染相对少见的区域，如果相同的技术在NTM病发病率高的地区使用，要高度关注由NTM造成的假阳性问题。

Xpert检测在获取结核病诊断结果的同时可以通过检测rpoB基因是否突变从而可以证实结核分枝杆菌是否对利福平耐药[15-16]。我国作为全球耐多药结核病高负担国家，骨关节结核耐药情况并不罕见，如果不能及时发现耐药，往往导致病灶清除手术失败，出现多次手术的现象，给患者及社会都会带来巨大经济损失。本研究发现在161 例 Xpert检测阳性的患者中，11例为利福平耐药。Xpert检测技术对骨关节结核耐药患者的早期发现，对患者治疗方案的制定具有十分重要的指导意义，在保证治疗成功率的同时，可节省大量的治疗经费，带来良好的社会效益。

综上所述，分子生物学技术的快速发展，弥补了传统结核病病理学和细菌学诊断的不足，诸如 Xpert检测等新型分子生物学诊断技术的推广应用，不仅可以提高骨关节结核的确诊率，还可以提早发现患者感染的结核分枝杆菌是否对利福平耐药。因此，在标本量足够的前提下，推荐联合多种病理学和细菌学检测技术，提高骨关节结核的确诊率。

利益冲突所有作者声明均不存在利益冲突

作者贡献苏丹、黄海荣：采集数据、统计分析、论文撰写和修改；车南颖、欧喜超：统计分析、论文撰写；赵颖丽、李琨：采集数据；陈学敬、林海峰、穆晶：统计分析、论文修改