中国异烟肼耐药结核分枝杆菌基因突变特征分析

田丽 周伟 黄星 吴显伟 张惠勇 鹿振辉 张少言

结核病是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)引起的一种慢性传染性疾病。耐多药结核病(Multi-drug resistant tuberculosis, MDR-TB)是指对至少包括异烟肼(INH)和利福平在内的2种以上药物产生耐药。INH是临床中常用的一线抗结核药物，但是由于治疗疗程长，导致患者中断治疗，可能会产生耐药性，耐药的发生还与MTB的基因突变有关。INH耐药相关的突变主要发生于katG和inhA启动子区，此外还有ahpC、fabG1、kasA、iniA/B/C、ndh、fadE、furA、Rv1592c和Rv1772及其启动子区等与INH耐药相关的基因。临床中常用的其他一二线药物如链霉素、氨硫脲、环丝氨酸和乙(丙)硫异烟胺等药物，MTB对其产生的耐药性比较稳定，耐药后很少复敏；利福平耐药后复敏率约为4.2%；而INH耐药后，停药36周可有88.5%的复敏率[1]。可见，INH在MDR-TB用药中的特殊性。因此，探究其耐药机制，明确其耐药基因突变特点及分布特征亦有助于MDR-TB诊治。为明确中国INH耐药结核分枝杆菌基因突变的分子特征，笔者对中国INH耐药基因及其启动子区突变特征进行总结和分析，为INH耐药及MDR-TB的诊断和治疗提供帮助。

资料和方法

一、 文献检索

英文文献检索以“Isoniazid resistance AND gene mutation ANDMycobacteriumtuberculosisAND China”“Isoniazid resistance AND Gene mutation ANDMycobacteriumtuberculosisAND Hong Kong” “Isoniazid resistance AND Gene mutation ANDMycobacteriumtuberculosisAND Macon” 和 “Isoniazid resistance AND Gene mutation ANDMycobacteriumtuberculosisAND Taiwan”检索式在PubMed数据库中检索截止2021年7月15日有关中国耐INH MTB基因突变的研究文献。

中文文献检索以“异烟肼耐药 并且 基因突变 并且 结核分枝杆菌”为检索式在中国知网、万方、维普数据库中检索截止2021年7月15日有关中国耐INH结核分枝杆菌基因突变的研究文献。

二、文献纳入和排除标准

1．纳入标准：(1)所研究的MTB菌株来源于中国(包括中国香港、中国澳门和中国台湾地区)；(2)MTB 对INH耐药表型测定方法为比例法或绝对浓度法；(3)应用DNA测序法、PCR法、基因芯片法或分子线性探针技术测定耐INH MTB突变基因序列；(4)研究结果包含基因突变位点和氨基酸变化等突变信息。

2．排除标准：(1)研究报告基因信息不详，仅有突变基因但既无突变位点信息又无碱基突变或氨基酸变化等相关信息的文献；(2)重复报道的文献，选取研究时间最新及研究菌株数量最多的文献，其他则排除；(3)二次研究文献。

三、文献筛选和数据提取

由2名中医学专业人员严格按照纳入和排除标准独立进行文献的检索、阅读和筛选，对不符合纳入标准的文献予以排除，最后进行菌株来源、数量、突变类型、突变位点、碱基变化或氨基酸变化、突变数量占比等数据的提取和分析。

四、统计学处理

对纳入文献提取的基因突变信息等计数资料使用Excel 2016软件进行合并计算。

结 果

一、文献检索结果

应用“文献检索”中“检索式”初步检索到139篇英文文献，511篇中文文献。中文文献来自中国知网249篇，万方200篇，维普62篇。通过阅读文献题目与摘要剔除重复及质量较低文献，初步筛选出216篇文献，其中英文文献 50篇，中文文献166篇。最后通过下载、阅读全文共筛选出69篇文献，其中英文文献20篇，中文文献49篇。检索流程见图1。纳入文献及菌株信息见表1。

图1 文献筛选流程图

表1 纳入文献菌株信息

二、6393株INH耐药MTB菌株基因序列分析结果

69项研究共对2000—2019年间24 630株MTB菌株进行了分析。按地区划分，中部地区(河南省、安徽省、湖南省、湖北省、江西省、山西省)共纳入5657株，占所纳入菌株数的22.97%；东部地区(江苏省、上海市、浙江省、福建省、广东省、海南省、台湾省)纳入6475株，占26.30%；西部地区(重庆市、四川省、西藏自治区)纳入1380株，占5.60%；南部地区(香港特别行政区、澳门特别行政区、广西壮族自治区、贵州省)纳入373株，占1.51%；北部地区(辽宁省、吉林省、黑龙江省、山东省、陕西省、河北省、天津市、宁夏回族自治区、北京市、内蒙古自治区、新疆维吾尔自治区、青海省、甘肃省)纳入9932株，占40.32%；未区分地区813株，占3.30%。其中有6393株INH耐药MTB菌株，占全部研究菌株数的25.96%。并应用DNA测序法、PCR法、基因芯片法或分子线性探针技术测定6393株INH耐药MTB突变基因序列。95.71%(6119/6393)检测到基因突变或缺失。其中katG、inhA、ahpC突变发生最多，分别占77.57%(4595/6393)、15.20%(972/6393)和3.69%(236/6393)。单基因单位点突变占87.80%(5613/6393)，联合突变占12.20%(780/6393)。各地区中东部耐INH菌株最多，katG突变构成比排前三位的依次为东部、北部和中部；inhA突变构成比从高到低依次为东部、中部和北部。具体基因突变情况见表2。各地区INH耐药菌株、katG、inhA基因突变菌株及构成比见表3。

表2 INH耐药基因突变情况

表3 不同地区INH耐药基因突变情况

katG基因单个位点突变出现最多的是第315位密码子的碱基置换或缺失，占INH耐药菌株总数的56.22%(3594/6393)。其次是第463位密码子，占10.03%(641/6393)。此外还有322、295、394位等41种密码子发生突变。在发生突变的315密码子中，突变类型最多的是315AGC→ACC，占32.13%(2054/6393)，其次为AGC→AAC的改变，占2.72%(174/6393)。氨基酸改变最多的是Ser→Thr(丝氨酸→苏氨酸)，占34.48%(2204/6393)，此外还有Ser→Asn(丝氨酸→天冬氨酸)、Ser→Gly(丝氨酸→甘氨酸)等形式的氨基酸改变。inhA基因单个位点突变最多的是15密码子的突变，占10.10%(646/6393)，第8密码子的突变也较常见。突变形式最常见的是C→T，约占10.03%(641/6393)。ahpC最常见的突变形式是C→T。在一些研究中，还检测到kasA、efpA、iniA、iniB、iniC等少见耐INH基因的突变。详见表4。

表4 6393株INH耐药菌株基因突变情况

讨 论

2019年，全球有近50万例耐利福平结核病(RR-TB)患者，其中78%的患者为MDR-TB[71]。耐药的发生与MTB的基因突变有关。主要是由于染色体、编码药物靶标的基因或药物激活酶的突变总体，影响药物与靶位酶结合而产生耐药[72]。MDR-TB的定义是基于MTB菌株对INH和利福平的耐药性，而INH是临床中治疗结核病常用的一线药物，可见INH在诊治结核病中的重要性。在抗结核药物中，INH的早期杀菌活性最强。有研究表明INH单药耐药与接受标准治疗的患者治疗成功的概率降低和导致耐药性的风险增加相关[73]。INH是一种前体药，分枝菌酸是分枝杆菌细胞壁的基本成分，INH结合并抑制一种参与分枝菌酸生物合成的酶inhA，最后导致分枝杆菌细胞死亡。INH需要过氧化氢酶和过氧化物酶或katG的细胞激活，才能转化为可对分枝杆菌产生毒性作用的活性形式。目前公认的最常见的INH耐药基因为katG和inhA[74]，最常见的突变密码子分别为katG315和inhA15。

本研究纳入文献菌株数西部、南部地区较少，这与该地区发表的相关研究文献数量较少有关。在基因突变中，各地区构成比差异明显，东部地区katG和inhA构成比均最高，中部地区InhA突变构成比较高，北部地区则katG突变较多。此外研究结果表明在6393株INH耐药菌株中，katG315(AGC→ACC)、463和inhA15突变最多，与之前国内报道相一致[74]。但是，由于大多数研究只对目前公认的耐INH的基因katG和inhA进行了测序，并未对aphC、fabG1、kasA、iniA/B/C等少见的基因进行测序。此外观察的密码子也多局限于315等常见的产生突变的区域。而在katG315之外也还有300多个突变在INH耐药中作用十分重要。所以，由于目前研究技术水平的限制，原始文献对耐INH基因的检测并不完全，而所纳入的研究时间跨度也较大(2003—2019年)，使得本次结果有所局限。但是本次纳入文献的发表单位均是结核病定点医院和专科医院等专业机构和部门，所纳入的菌株数量也达到了24 630株，覆盖了全国除云南省、澳门特别行政区外的全部省市，也未见既往对全国范围内INH耐药基因突变的相关研究，所以本研究在一定程度上可以代表中国INH耐药MTB菌株的总体情况。

利益冲突所有作者均声明无利益冲突