多粘类芽孢杆菌胞外多糖的功能研究进展

和林松 陶玲庆 韦露萍 费孝桐 朱玉雪 赵永清

摘 要：多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）属于芽孢杆菌属，是一类产芽孢的革兰氏阳性细菌，可以产生多肽类、蛋白类、酶类、功能性多糖及其他代谢活性物质。现代研究表明，多糖类化合物具有广泛的生理功能。随着研究的不断深入，多粘类芽孢杆菌胞外多糖已被证明具有抗氧化性、免疫活性、抗肿瘤性等功能，在生物医药领域及生态农业方面有着广泛的发展前景。该文综述了多粘类芽孢杆菌菌株来源及其胞外多糖的发酵工艺、提取、分离纯化、结构分析及功能方面的研究进展，并对其未来的发展研究进行了展望。

关键词：多粘类芽孢杆菌;胞外多糖;发酵工艺;提取;结构分析;生物活性

中图分类号 Q939.124 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2022）06-0041-05

Research Progress on Extracellular Polysaccharides of Bacillus polymyxa

HE Linsong1   TAO Lingqing1   WEI Luping1   FEI Xiaotong1   ZHU Yuxue1   ZHONG Yongqing1，2

（1Life Science and Engineering College， Northwest Minzu University， Lanzhou 730030， China; 2Biomedical Research Center， Northwest Minzu University， Lanzhou 730030， China）

Abstract： Paenibacillus polymyxa belongs to the genus Bacillus， a type of spore-producing Gram-positive bacteria， Bacillus polymyxa can produce polypeptides， proteins， enzymes， functional polysaccharides and other metabolically active substances. Modern research shows that polysaccharide compounds have a wide range of physiological functions. With the deepening of research，the extracellular polysaccharide of Bacillus polymyxa has been proven to have antioxidant， immune， and anti-tumor functions， and has broad development prospects in the field of biomedicine and ecological agriculture. This article reviews the source of Bacillus polymyxa strains and the research status of its extracellular polysaccharide fermentation technology， extraction， separation and purification， structure analysis and function in recent years， and prospects for its future development research.

Key words： Paenibacillus polymyxa; Extracellular polysaccharide; Fermentation process; Extraction; Structural analysis; Biological activity

多粘類芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）是类芽孢杆菌的模式菌[1]。类芽孢杆菌属于革兰氏阳性好氧或兼性厌氧菌，能产生芽孢，抗逆性极强，在高酸、高碱、高寒、高盐的逆境下生长良好[2]。其细胞呈直杆状，菌落特征多成浅黄色或白色的黏稠状，表面湿润光滑;靠周生的鞭毛运动，膨大孢子囊中产生椭圆形芽孢;最适生长温度为28～35℃，最适pH7.0，能产酸，有时产气[3]。多粘类芽孢杆菌广泛存在于自然界中，多数在植物体内外及根际土壤中分离而来，作为一类重要的根际有益菌[4]，其具有促进植物生长和生物防治的作用，被广泛应用于农业领域。多粘类芽孢杆菌具有良好的生物学活性物质，如蛋白质类、多糖、多肽类、脂类[5]。近年来的研究表明，多粘类芽孢杆菌胞外多糖具有净化水质[6]，吸收废水中的重金属离子[7]等作用，在环境生态领域中具有重要的应用价值。此外，它还具有抗氧化性、抗肿瘤性、调节免疫等生物活性，在医药领域中有着重要作用。多粘类芽孢杆菌产胞外多糖在农药助剂方面也发挥着重要作用，包括助悬浮和热保护作用[8]。多粘类芽孢杆菌有多种生物学活性，对人畜安全和无污染，具有广泛的应用前景而受到青睐，美国环保署（EPA）将其列为可在商业上应用的微生物[9]。

胞外多糖作为一种生物材料的来源，近年来受到了越来越多的关注。微生物多糖具有生产过程可控性高、不受外界因素影响、生产周期短，具有独特的理化性质及生物活性等优势，已被广泛应用于各个领域。微生物多糖由范围极广的单糖构成，具有十分复杂的结构，其活性受发酵条件、提取工艺、纯度、含量等多因素的综合影响。因此，菌株发酵的条件及胞外多糖的提取、分离纯化对后续结构分析鉴定及其活性功能的研究尤为重要。在多粘类芽孢杆菌发酵过程中，会产生大量的胞外多糖，容易分离提取。本文综述了多粘类芽孢杆菌的来源及其多糖的提取工艺、纯化、结构分析及其功能进展，并对未来相关领域研究进行了展望，为多粘类芽孢杆菌胞外多糖的综合应用以及进一步研究提供参考。

1 菌株来源

多粘类芽孢杆菌在自然界中分布广，广泛分布于土壤、植物的体表以及根部，也是常见的植物内生菌。目前，多粘类芽孢杆菌多从植物的根际土壤中分离而来。刘训理[10]等从泰山土壤中分离得到1株对多种动植物病原细菌和真菌具有较强拮抗作用的多粘芽孢杆菌Cp-s316。陈雪丽[11]等从大豆根际土壤中分离得到多粘芽孢杆菌BRF-1。张道敬[12]等在番茄的根际土壤中分离得1株生防菌株多粘芽孢杆菌HY96-2。林茂兹[13]等从太子参根际土壤中筛选出对尖孢镰刀菌有很强抑制作用的多粘类芽孢杆菌S960。张宏福[14]等从中华芦荟中分离到1株植物内生菌多粘类芽孢杆菌A11，并且对该菌进行了全基因组测序。吴棣[15]等自中国贵州辣椒根际土壤中分离得一株具有良好的拮抗性能并具有较好的植物促生及溶磷、解钾的能力的多粘类芽孢杆菌SC2。鄂垚瑶[16]等从西瓜种植发病区健康植株根际分离得到的一株兼具促生及生防功能的根际有益菌多粘类芽孢杆菌SQR-21。李玉洋[17]等从水稻根际土壤中筛选得到1株对水稻恶苗病菌拮抗作用较强的多粘类芽孢杆SH15。王波[18]等从大豆植株中分离得到多粘类芽孢杆菌XZ-2。

2 发酵工艺

在发酵产胞外多糖的过程中，发酵培养基成分和发酵条件对胞外多糖的合成至关重要，通过优化培养基成分和发酵条件促进菌体生长及其生理代谢，是提高胞外多糖产量的重要手段，成为优化多糖生产工艺的研究热点。优化发酵工艺通常使用单因素试验、正交试验、响应面设计方法相结合，综合探究不同因素之间的交互作用。

2.1 培养基优化 培养基组分在很大程度上影响著微生物生长及其代谢产物的积累，适合菌体生长繁殖的培养基不一定适合于代谢产物的积累。不同的菌株对碳源、氮源、生长因子和无机盐离子等营养物质种类和浓度的要求大有不同，不同代谢物的产生对这些要求也不同。因此，为提高多糖产率，需对培养基成分进行优化。碳源不仅是微生物菌体的能源物质，也是合成菌体和目的产物的碳成分提供者。碳源对菌体产多糖的数量和质量起着关键作用。不同的碳源对微生物的生长及其多糖的合成有一定的影响。氮源是细胞物质（氨基酸、蛋白质、核酸等）和含氮代谢物的组分，是菌体生长繁殖的必需营养素，为微生物生长提供营养所需的氮元素，也是合成多糖的重要成分，适宜的氮源及添加量有利于多糖的合成。无机盐及微量元素是微生物生理活性物质的组成或生理活性作用的调节物，一般在低浓度有促进作用，在高浓度有抑制作用。不少研究表明，对于多粘类芽孢杆菌产多糖，蔗糖是最佳碳源。如刘俊等[19]先用单因素实验方法筛选影响胞外多糖的产量因子，再用响应面法对碳源、氮源和无机盐的培养基成分进行优化，最终确定最佳培养基组合为蔗糖188.2g/mL、酵母膏25.8g/mL、氯化钙0.34g/mL，其提取量高达35.26g/L。蹇华丽等[21]采用单因素实验法，以多糖产量为指标，对多粘类芽孢杆菌PS04发酵培养基成分进行优化，最终确定蔗糖是最佳碳源，最适浓度150g/L，最佳氮源为无机氮NH4NO3，最适浓度1.4g/L。王波[18]等采用单因素试验和正交试验相结合的方法对多粘类芽孢杆菌XZ-2的培养基组分进行优化研究，得出利用蔗糖发酵产糖量最高，其最佳培养基组成为蔗糖15g/L、蛋白胨15g/L、硫酸镁5g/L、氯化钙3g/L。

2.2 发酵条件优化 微生物的正常生长繁殖，需要适应的环境。在胞外多糖发酵生产中，除培养基的成分及浓度外，培养温度、初始pH、发酵时间、通气量、接种量等工艺条件也是主要的影响因素。只有将这些外界条件控制在适合菌种发酵的最优水平，才能提高多糖的产量。温度是影响微生物生长的重要因素，它会影响菌中的酶活性，进而会影响微生物体内所进行的各种生化反应，对微生物的影响是最为广泛的。在一定范围内，适宜的温度促进菌体生长，促进代谢活性物质的产生;不适的温度则会影响微生物的代谢。pH值也会影响菌中酶的活性，直接影响菌类的正常生长和代谢，pH过高或过低均会影响多糖产量。到目前为止，已有不少关于多粘类芽孢杆菌产多糖培养条件的报道。杨树丽[20]采用单因素试验法确定了类芽孢杆菌C-12菌株的最佳发酵条件为温度30℃，初始pH6.0，转速160r/min，接种量6%。蹇华丽[21]采用单因素法和响应面设计对菌株PS04发酵产多糖的工艺进行优化，最终得出初始pH值为8.22、发酵温度37℃、接种量4%、发酵周期48h时，多糖产量可达到60.04g/L，约为发酵条件未优化时产量的6倍。表明通过响应面设计方法对发酵条件进行优化可以明显提高多糖的产率。杨棒棒[22]等在类芽孢杆菌ZX-5产胞外多糖发酵条件优化中，先对碳源、氮源、温度、pH、碳浓度、氮浓度进行单因素试验，得出温度、碳源浓度、氮源浓度对产多糖具有显著影响，再选用这3个因素进行响应面试验，分析多糖产量的交互作用，得到最佳的产糖温度条件为20℃，在优化条件下产糖量达到34.55g/L，是基础水平的2.01倍。

3 提取与纯化

目前，微生物胞外多糖的提取一般采用离心除菌体、有机溶剂沉淀、去除蛋白、透析、冷冻干燥等步骤得多糖粗品，其纯度较低，常含有色素、蛋白质和小分子物质等杂质。杂质的存在不仅降低了多糖的纯度，也影响对其结构与生物活性的研究。利用凝胶柱层析、离子交换柱层析等手段进行纯化，可得到纯度较高的多糖样品。

3.1 提取 多粘类芽孢杆菌多糖为胞外产物，分离过程一般先要去除菌体。高速离心是除菌体最常用的方法。然而，多糖的高粘度性会使发酵液难于离心，因此，有研究者采用先稀释发酵液再离心的方法，也有研究者在处理发酵液前先加热发酵液[23]。加热会使结合在细胞壁上的多糖脱离细胞，同时使蛋白质变性沉淀[24]。因此，发酵液先经热处理，再冷却稀释离心更适合高粘度的多粘类芽孢杆菌发酵液中多糖的提取。用乙醇沉淀是最常用的多糖提取方式[25]。不同菌株发酵液中多糖的提取率与乙醇的浓度有很大影响。如贾杰[26]等用1倍体积的乙醇沉淀多粘类芽孢杆菌HY96-2胞外多糖。田文祥[27]等用3倍体积的95%乙醇沉淀多粘类芽孢杆菌PS04胞外多糖。有机溶剂在低温下可提高其沉淀量，促进沉淀速度，所以多数研究者使用有机溶剂时先经预处理再沉淀，或是在低温条件下进行沉淀。

3.2 除蛋白 多糖中的蛋白以游离蛋白和结合蛋白2种存在形式，这些蛋白会随多糖沉淀下来。多糖除蛋白有3种方法：（1）强酸处理使蛋白质变性沉淀，如三氯乙酸除蛋白，三氯乙酸能使蛋白质带正电荷，并与负离子结合成不溶性的盐类[28]。（2）Sevage法;利用有机溶剂使溶液中的蛋白质变性而分离蛋白质。（3）酶解法：强酸除蛋白的效率可能更高，但是反应剧烈，在蛋白质变性的同时可能会导致多糖的分解，进而降低多糖的提取率。酶解法具有条件温和、多糖损失率低等优点，但酶法不能完全去除多糖中的蛋白质。Sevage法效率较低，需要重复操作，但对多糖的结构影响不大，更为温和、可靠。因此，多粘类芽孢杆菌多糖中蛋白的去除，一般采用Sevage法[氯仿：正丁醇=5∶1（V∶V）]。

3.3 纯化 在进行多糖的提取时，提取物中通常含有蛋白质、色素、无机盐等多种杂质，在进行多糖的结构分析鉴定和生物活性等方面研究前需要对多糖提取物进行除杂、分离纯化，以得到较高纯度的单一多糖。微生物胞外多糖常为中性或弱酸性，因而可根据其电荷性质及其结构特点，选取合适的方法进行分级纯化。实验中常采用分步沉淀法、凝胶色谱法、超滤法、层析分离法、离子交换树脂法等方法进行分离纯化。张道敬等[12]对乙醇沉淀法提取得的粗多糖用DEAE-纤维素柱法进行分离纯化，得出组分B和组分D，用高效液相色谱法检测它们的纯度，并对组分B采用气相色谱法分析其单糖组成。由于单一的纯化方法通常无法得到较高纯度的多糖，因此在研究过程中通常需要联合使用多种方法。

4 结构分析

多糖的结构分析主要包括多糖的单糖组分、多糖的分子量和糖苷键的连接方式。多糖具有復杂的结构，常用电泳法、酸解法、红外光谱分析法（infrared spectroscopy，IR）、紫外-可见分光光度法（ultraviolet and visible spectropHotometry，UV）、气相色谱法（gas chromatograpHy，GC）、高效液相色谱法（high performance liquid chromatograpHy，HPLC）、质谱法（mass spectrometry，MS）、高效凝胶渗透色谱法（high performance gel permeation chromatograpHy，HPGPC）、核磁共振法（nuclear magnetic resonance，NMR）等方法对多糖进行结构分析鉴定。蹇华丽[27]等采用丙烯葡聚糖凝胶S-200 HR对多粘类芽孢杆菌PS04多糖进行过滤层析，并通过凝胶渗透色谱法分析测定，结合红外光谱、高效液相色谱及核磁共振分析，确定该多糖是由果糖与葡萄糖以7∶1的比例组成，且果糖残基以呋喃环构型存在，以β-2，6、β-1，2键连接。张道敬等[12]采用凝胶渗透色谱法（GPC）、气相色谱法（GC）测定了多粘类芽孢杆菌HY96-2的多糖组分B的分子量，得组分B的分子量为1.22×106Da，并确定其含有5种单糖：鼠李糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖，它们的摩尔比为2.52∶0.25∶1∶1.61∶2.24，是一种新结构多糖。多糖的功能性质与结构特点、空间构象密切相关，借助以上手段有效分析多糖的构型、化学键等结构特征，有助于研究其生理活性和药理作用机制。

5 多粘类芽孢杆菌的功能

近几年的研究表明，多糖不仅是细胞的结构物质和能源物质，也是具有多功能的生物活性物质。此外，功能性多糖还具有抗肿瘤、消炎、抗氧化性、抗凝血等作用，可用于生态环保等领域。

5.1 增强免疫力 多糖种类丰富、结构复杂，是生物体内一种重要的聚合物，具有显著的生物学活性，能提高机体淋巴细胞与巨噬细胞的数量、增加细胞因子的释放、调节机体的免疫系统，提高机体的免疫力[29]。多粘类芽孢杆菌产生的葡聚糖可以减轻小猪炎症的发生程度[30]，将该种多糖作为饲料添加剂可提高动物的免疫力。刘俊等[19]研究表明，给D-半乳糖诱导的衰老小鼠灌胃胞外多糖，可提高小鼠的脾脏和肝脏指数，从而增强小鼠的免疫功能。P. polymyxa JB115[31]中提取分离的β-葡聚糖能刺激机体增强免疫能力，是一种很好的免疫增强剂。

5.2 抗肿瘤 肿瘤是一种常见病、多发病，其中恶性肿瘤是目前危害人类健康最重要的一类疾病。肿瘤细胞会诱导淋巴细胞凋亡，导致器官萎缩，从而降低宿主免疫力，产生危害。寻找具有抗肿瘤活性的物质已成为许多科研人员努力的方向。Chang等[32]研究P. polymyxa JB115发现，其[β]-葡聚糖可诱导巨噬细胞中产生NO，NO可作为信号分子进一步发挥神经传导、疏通血管以及促进巨噬细胞清除肿瘤细胞。

5.3 抗氧化 细胞正常代谢过程中产生的活性氧具有双重功能，低浓度的活性氧对生长因子的应答、免疫反应起重要作用;高浓度的活性氧则会破坏细胞中的DNA、脂类和蛋白质，从而提高致癌性。有研究指明，多粘类芽孢杆菌的胞外多糖有较强的抗氧化性。Liu等[33]研究P. polymyxa EJS-3胞外多糖的抗氧化性，体外通过测定H2O2清除活性、DPpH自由基清除活性、Fe2+螯合剂活性、脂质体过氧化抑制效果等，体内试验以D-半乳糖诱导的小鼠为对象做生物测定，实验结果表明该多糖有抗氧化活性，可以作为新型的天然抗氧化剂应用于医药领域多种疾病的治疗以及开发新型化妆品。

5.4 其他方面作用 除上述的活性外，多粘类芽孢杆菌胞外多糖还具有乳化、净化水质的作用。一些研究表明，P. polymyxa产胞外多糖具有净化水质的作用[34]。Mokaddem等[35]研究表明，P. polymyxa CHL0102产多糖类物质，可吸附污水中的镉离子，说明该类细菌可用于废水中重金属离子的去除，达到净化污水的目的。P. polymyxa GA1[36]产生的大分子多糖可作为絮凝剂，对污水有很好的处理效果，其絮凝机是通过架桥作用使分散的颗粒聚集从而达到固液分离。多粘类芽孢杆菌在污水处理方面具有广阔的前景。此外，P. polymyxa[37]产胞外多糖具有低浓度下高黏性、假塑性、耐盐性，同时对热和酸碱有很好的稳定性等优良性质。一些文献报道，P. polymyxa[38，39]产胞外多糖在农药助剂方面也有一定的作用，包括助悬浮、免受紫外和热损伤。

6 展望

由于地理来源和采集环境的不同以及分泌不同代谢物质所需营养素的不同，不同多粘类芽孢杆菌的培养基成分和培养条件之间存在差异，需要通过较多的试验次数和周期才能优化筛选出最佳结果。现阶段，对多粘类芽孢杆菌培养基的探索大多是笼统的优化筛选组分及发酵条件。多粘类芽孢杆菌作为一种有益菌，具有多种可利用的生物特性，提高发酵产量，高效的提取、分离纯化及更深入的结构分析、生理活性研究将有利于对其多糖的充分利用。

目前，多糖类依旧是国内外天然化学领域的研究热点之一，具有广阔的应用前景。但国内对多粘类芽孢杆菌胞外多糖的研究不足，我国对于多粘类芽孢杆菌多糖的开发利用还不够全面。对多粘类芽孢杆菌代谢活性物质的研究主要集中在多肽类、脂类、蛋白质类，而在多糖及其活性的研究较少，对其他代谢产物的研究主要集中在功能和基本的理化性质上，其中对蛋白质类、多肽类的作用机理研究比较深入、比较系统。对多糖的研究多数是针对其提取、纯化、单糖鉴定，仅局限在分析单糖组成和糖苷键的连接方式，而对其功能研究较浅，如抗肿瘤机制的研究报道甚少，其作用机理尚不明确，胞外多糖的抗肿瘤机制有待进一步研究，这将是研究多糖的重要方向。

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（责编：张宏民）