百里香酚和迷迭香酸对脂多糖攻毒大鼠盲肠屏障、菌群及炎症的影响

吴佳庆,李润林,李盼盼,雷铭康,杨雅杰,汪晶,朱伟云

(南京农业大学动物科技学院/国家动物消化道营养国际联合研究中心/动物科学类国家级实验示范中心,江苏 南京 210095)

肠道屏障是机体抵御病原体入侵的第一道屏障,并且是影响肠道健康的关键因素。肠黏膜的物理屏障、化学屏障、微生物屏障及免疫屏障这四大屏障的有机结合,可以发挥对营养素的选择性吸收、防御病原微生物入侵等作用[1]。其中,微生物屏障功能在维持肠道健康中发挥重要作用:一方面肠道微生物通过上调肠黏膜紧密连接基因mRNA的相对表达量,促进杯状细胞分化,提高黏蛋白分泌,增强肠道屏障功能[2-3];另一方面肠道微生物代谢碳水化合物产生短链脂肪酸(SCFA)等物质,能促进肠上皮细胞的能量吸收,并可以降低肠道pH值,从而抑制致病菌的生长。所以,一旦肠道菌群结构失衡,大量致病菌会在肠道内定殖,从而引发肠道炎症等疾病[4]。盲肠是肠道中细菌密度最高、种类最丰富的区域,也是微生物发酵碳水化合物的重要场所[5-6]。

植物提取物是从植物中提取出来的天然活性物质,绿色无污染,具有多种益生作用,如缓解炎症反应,调节肠道菌群平衡等[7]。目前,单一植物提取物添加量大、效果单一的缺点使得复合植物提取物的开发利用越来越受到关注[8]。百里香酚(thymol)是百里香油和牛至油的主要组成成分,其可以促进仔猪肠道消化吸收,改善肠道菌群[9]。还有研究发现,迷迭香中的迷迭香酸(rosmarinic acid)等酚酸类物质,具有抗氧化、抗菌、抗炎等药理作用[10],还能显著抑制二甲苯诱导的耳壳肿胀小鼠毛细血管的通透性,并降低血清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)、C型反应性蛋白(CRP)的产生[11]。近年来,关于百里香酚和迷迭香酸缓解炎症反应,改善肠道健康等方面的研究报道较多[12-16],但未见关于这2种植物提取物组合使用的研究报道,且本实验室前期体外研究发现百里香酚和迷迭香酸两者组合具有协同抑菌和抗氧化的作用。因此,我们推测百里香酚和迷迭香酸组合可以通过提高肠道屏障功能、调节肠道菌群结构以及缓解炎症反应来改善动物肠道健康。因此,本试验拟通过脂多糖(LPS)诱导的大鼠肠道炎症模型,研究百里香酚和迷迭香酸组合对大鼠盲肠屏障功能、菌群结构及炎症反应的影响,为其在缓解肠道炎症反应,改善动物肠道健康等方面提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2019年12月至2020年7月在南京农业大学实验动物房完成。试验用无特定病原菌(SPF)Sprague-Dawley(SD)大鼠购自南京医科大学实验动物中心;LPS购自上海生工生物工程有限公司;试验用百里香酚和迷迭香酸(纯度≥98%)购自百灵威公司。

1.2 试验动物与试验设计

试验选取40只初始体重为(54.86±2.26)g的21日龄SD大鼠,在适应性饲养7 d后随机分为5组:空白对照组(Con)、攻毒对照组(LPS)、百里香酚组(Thy)、迷迭香酸组(RosA)、百里香酚×迷迭香酸组(Thy × RosA)。每组8只,公母各半。Thy组、RosA组和Thy × RosA组每天分别按照20 mg·kg-1Thy、20 mg·kg-1RosA、20 mg·kg-1Thy × RosA(1∶1)的剂量对大鼠进行灌胃操作,Con组和LPS组每天灌胃等量生理盐水。正式试验期共14 d。在正式试验第13 天,除Con组外,对LPS组、Thy组、RosA组和Thy × RosA组大鼠腹腔注射500 μg·kg-1的LPS溶液建立急性肠道炎症模型,Con组注射等量生理盐水。在第14天将大鼠处死,采集盲肠中段组织、黏膜及食糜样品。试验期间大鼠自由采食和饮水,按照常规免疫、消毒程序饲养管理。大鼠饲料购自南京青龙山动物繁殖场。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 盲肠组织形态结构的观察将采集的盲肠组织置于4%(体积分数)多聚甲醛溶液中固定。参照常规方法制作石蜡切片并进行苏木精-伊红(HE)染色。利用虚拟显微镜(Simon-01)观察肠道切片的形态结构。

1.3.2 盲肠黏膜相关因子浓度的测定称取0.1 g左右的盲肠黏膜加到匀浆介质试剂中制备成10%的匀浆液,于4 ℃、3 000 r·min-1条件下离心15 min,收集上清液。采用蛋白质定量检测试剂盒(南京建成)的BCA法测定总蛋白浓度后用ELISA试剂盒(南京建成)测定盲肠黏膜上清液中白细胞介素1β(IL-1β)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素10(IL-10)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、二胺氧化酶(DAO)和D-乳酸的浓度。

1.3.3 盲肠黏膜紧密连接相关基因mRNA的表达参照Chomczynski等[17]的方法提取盲肠黏膜总RNA,反转录体系和反应程序参照试剂盒(TaKaRa)说明书。以β-actin作为内参基因进行相关基因的实时荧光定量PCR(qPCR)分析。反应体系和反应程序参照SYBRPremixExTaq试剂盒(TaKaRa)说明书。引物序列如表1所示。计算盲肠黏膜紧密连接蛋白ZO-1、Claudin-1、Occludin基因mRNA的相对表达量。

表1 PCR所用引物序列

1.3.4 盲肠食糜中菌群代谢产物短链脂肪酸的测定称取0.3 g左右的盲肠食糜于1.5 mL离心管中,加入1.2 mL双蒸水混匀。4 ℃、12 000 r·min-1离心10 min。取上清液0.8 mL,加入 0.16 mL 25%偏磷酸巴豆酸混合溶液,-20 ℃保存过夜。用进样针取0.1 μL上清液,瞬时注入气相色谱仪(日本岛津GC-14B型)中,气相色谱仪参数设置参照Mao等[18]的方法:毛细管色谱柱柱长30 m、内径0.32 mm、膜厚0.25 μm(美国Sigma-Aldrich),柱温135 ℃,氢火焰离子检测器温度200 ℃,载气为氮气,压力60 kPa,氧气和氢气压力均为50 kPa。

1.3.5 盲肠菌群的高通量测序参考Wang等[19]的方法,提取和纯化盲肠食糜总DNA后,使用微量分光光度计检测DNA的浓度和纯度,并将DNA浓度统一稀释到500 ng·mL-1。以稀释后的DNA为模板,以前端引物序列319F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和后端序列806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)的特异引物,对盲肠菌群16S rRNA基因的V3—V4区进行PCR扩增,扩增产物用20 g·L-1琼脂糖凝胶进行电泳检测;使用AxyPrep DNA凝胶提取试剂盒(美国Axygen生物科技公司)对PCR产物进行纯化处理。最后,在Illumina MiSeq平台上对PCR产物进行末端配对测序。每组8个生物学重复。

1.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 脂多糖(LPS)攻毒对大鼠盲肠形态结构的影响

由HE染色的组织切片(图1)观察发现:Con组大鼠盲肠组织结构完整,形态正常,无明显病变;LPS组大鼠盲肠结构损伤严重,出现炎性细胞浸润,黏膜层水肿等情况。Thy组、RosA组和Thy × RosA组大鼠盲肠形态结构完整,绒毛排列整齐,无明显病变。

图1 百里香酚和迷迭香酸对大鼠盲肠形态结构的影响

2.2 百里香酚和迷迭香酸对大鼠盲肠菌群结构及代谢产物的影响

2.2.1 对盲肠食糜微生物多样性的影响α多样性通常用来描述微生物群落的多样性和丰富度。使用辛普森(Simpson)指数和香农指数(Shannon)来表示菌群多样性,Chao1指数和ACE指数代表菌群丰富度。α多样性试验结果(表2)表明:LPS组、Thy组、RosA组、Thy × RosA组盲肠菌群α多样性无显著差异(P>0.05)。层次聚类树可对不同层次的群落进行划分,从而形成聚类结构,而主坐标分析(PCoA)用于研究样本间距离的相似性。基于OTU水平的层次聚类树(图2-A)和PCoA分析(图2-B)结果表明,4组间盲肠微生物菌群显著分开,并且组间具有显著差异(R2=0.538 1,P=0.001)。

表2 百里香酚和迷迭香酸对大鼠盲肠食糜微生物α多样性指数的影响

图2 百里香酚和迷迭香酸对大鼠盲肠菌群β多样性指数层次聚类树(A)和主坐标分析(PCoA,B)的影响

2.2.2 对盲肠食糜菌群结构的影响盲肠菌群在门水平上相对丰度结果(图3-A)表明:厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidota)为4组间盲肠菌群的优势菌门。与LPS组相比,厚壁菌门(Firmicutes)相对丰度在Thy组、RosA组和Thy × RosA组中显著增加(P<0.05),拟杆菌门(Bacteroidota)丰度显著降低(P<0.05)(图3-B)。

图3 百里香酚和迷迭香酸对大鼠盲肠微生物门水平菌群组成(A)和菌群变化(B)的影响

属水平上丰度>1%的菌属中(图4-A),未定义的鼠杆菌科、乳酸杆菌属、毛螺菌科NK4A136组、阿克曼菌属和Romboutsia为4组的优势菌属。与LPS组相比,乳酸杆菌、Turicibacter和致狭窄梭状芽胞杆菌1的相对丰度在RosA组和Thy × RosA组中显著增加(P<0.05),Romboutsia在Thy × RosA组中显著增加(P<0.05)。与LPS组相比,未定义的鼠杆菌科、未分类的毛螺菌科、罗斯氏菌属、Alistipes的丰度在Thy × RosA组中显著降低(P<0.05)(图4-B)。

图4 百里香酚和迷迭香酸对大鼠盲肠微生物属水平菌群组成(A)和菌群变化(B)的影响

2.2.3 对盲肠食糜短链脂肪酸浓度的影响对短链脂肪酸浓度的测定结果(表3)表明:Thy × RosA组盲肠中乙酸、丁酸和总短链脂肪酸浓度显著高于Con组、LPS组、Thy组和RosA组,丙酸浓度显著高于Con组、LPS组和RosA组(P<0.05)。

表3 百里香酚和迷迭香酸对大鼠盲肠食糜短链脂肪酸浓度的影响

2.3 百里香酚和迷迭香酸对大鼠盲肠屏障功能的影响

2.3.1 LPS攻毒对大鼠盲肠D-乳酸含量和二胺氧化酶活性的影响由图5可知:与Con组相比,LPS攻毒显著降低了盲肠D-乳酸含量(P<0.05)。与LPS组相比,Thy组、RosA组和Thy × RosA组中D-乳酸含量显著升高(P<0.05),二胺氧化酶活性在RosA组和Thy × RosA组中显著升高(P<0.05)。

图5 LPS攻毒对大鼠盲肠D-乳酸含量和二胺氧化酶(DAO)活性的影响

2.3.2 对盲肠紧密连接相关基因mRNA表达的影响由图6可知:与LPS组相比,ZO-1、Occludin、Claudin-1基因mRNA表达量在Thy × RosA组中显著增加(P<0.05),且Thy × RosA组的ZO-1和OccludinmRNA表达量显著高于RosA组,Claudin-1mRNA表达量显著高于Thy组和RosA组(P<0.05)。

图6 百里香酚和迷迭香酸对大鼠盲肠紧密连接基因mRNA相对表达量的影响

2.4 百里香酚和迷迭香酸对大鼠盲肠炎症因子IL-1β、 IL-6、TNF-α和IL-10水平的影响

由图7可知:与LPS组相比,IL-1β水平在Thy组、RosA组和Thy × RosA组中显著降低(P<0.05),IL-6水平在RosA组和Thy × RosA组中显著降低(P<0.05)。与LPS组相比,Thy × RosA组中TNF-α水平呈下降趋势(P=0.084),IL-10水平呈上升趋势(P=0.082)。

图7 百里香酚和迷迭香酸对大鼠盲肠炎症因子水平的影响

3 讨论

目前,利用脂多糖(LPS)攻毒大鼠建立急性肠道炎症模型来探究药物的抗炎效果和作用机制逐渐成为研究炎症的常用方法。研究表明,LPS刺激会导致肠道功能紊乱,肠道屏障功能受损,进而使病原体等有害物质移位到血流中,并诱导炎症因子产生,从而引发炎症反应[7]。因此,LPS经常被用作诱导炎症反应的物质[20]。据报道,小鼠腹腔注射10 mg·kg-1LPS溶液后状态萎靡不振,且肝脏组织切片出现炎性病理变化[20],本研究结果与之相一致。本试验选用500 μg·kg-1LPS攻毒断奶大鼠来建立炎症反应模型,结果发现,LPS组大鼠腹腔注射LPS后出现战栗、颤抖、呼吸急促、精神萎靡不振等症状,并且,HE染色结果显示,LPS攻毒使大鼠盲肠形态结构出现了明显的炎性病理变化。以上结果说明腹腔注射500 μg·kg-1LPS使大鼠出现了炎症反应。

越来越多的研究表明,维持肠道菌群的动态平衡在缓解炎症反应,改善动物肠道健康方面发挥重要作用。在生物统计学中,α多样性和β多样性通常用来分析微生物群落的组成和丰度。在本试验中,微生物多样性的结果表明,LPS组、Thy组、RosA组和Thy × RosA组4组间盲肠菌群α多样性无显著变化,但β多样性的结果显示,4组微生物菌群显著分离,表明4组间盲肠菌群组成具有显著差异。

盲肠菌群门水平相对丰度的结果表明,与LPS组相比,厚壁菌门的相对丰度在Thy组、RosA组和Thy × RosA组中显著升高,拟杆菌门的相对丰度显著降低。研究证实,厚壁菌门与纤维素的降解和抗炎作用有关[21],而拟杆菌门属于革兰氏阴性菌,在一定条件下(肠道屏障受损、菌群结构失衡、机体抵抗力下降等)有可能成为条件致病菌[22]。在属水平上,与LPS组相比,乳酸杆菌、Romboutsia、Turicibacter和致狭窄梭状芽胞杆菌1的相对丰度在Thy × RosA组中显著增加,未定义的鼠杆菌科、未分类的毛螺菌科、罗斯氏菌属、Alistipes的丰度显著降低。乳酸杆菌、Romboutsia、Turicibacter和致狭窄梭状芽胞杆菌1等通常被认为是有益于肠道健康的潜在益生菌[23-25]。例如,乳酸杆菌具有改善肠道微生态环境,增强肠道屏障功能和提高机体免疫力的作用[26]。有研究发现,运动和维生素C摄入的大鼠肠道中短链脂肪酸产生菌Romboutsia和Turicibacter的相对丰度显著上调[27],致狭窄梭状芽胞杆菌1的代谢产物以短链脂肪酸为主[23]。而Alistipes在先天性免疫防御机制缺失的大鼠菌群中显著富集[28],且与炎症及代谢相关基因的表达显著相关[29]。与LPS组相比,未定义的鼠杆菌科、未分类的毛螺菌科和罗斯氏菌属的相对丰度在Thy × RosA组显著降低,可能是由于乳酸杆菌、Romboutsia和Turicibacter所占比例较高,导致其相对丰度降低。门水平和属水平相对丰度的结果表明百里香酚和迷迭香酸组合显著增加盲肠食糜中乳酸杆菌和Romboutsia等潜在益生菌的相对丰度,降低Alistipes机会致病菌的相对丰度,优化了盲肠菌群结构。

肠道菌群可发酵碳水化合物产生一系列代谢产物,如短链脂肪酸等物质,主要包括乙酸、丙酸和丁酸,它们有可缓解肠道炎症反应,促进肠上皮细胞的能量吸收和维持肠道微生态平衡的作用[30]。本研究中,与LPS组相比,乙酸、丙酸、丁酸和总短链脂肪酸浓度在Thy组、RosA组和Thy × RosA组中显著升高,且在Thy × RosA组中浓度高于或显著高于Thy组和RosA组。这可能与高通量测序结果中盲肠乳酸杆菌、Romboutsia、Turicibacter和致狭窄梭状芽胞杆菌1在Thy × RosA组的相对丰度增加有关,而乳酸杆菌、Romboutsia、Turicibacter和致狭窄梭状芽胞杆菌1均与碳水化合物的代谢、短链脂肪酸的产生有关[23-25]。表明百里香酚和迷迭香酸组合可显著提高大鼠盲肠食糜短链脂肪酸的浓度,且浓度高于Thy组和RosA组。

大量研究表明,某些益生菌(如乳酸杆菌和双歧杆菌)的定殖会导致短链脂肪酸浓度的升高,有助于缓解肠道炎症反应,提高肠道黏膜的屏障功能,抵御病原体的入侵[31-32]。肠道菌群自身构成的微生物屏障作为肠道屏障功能的4大屏障之一,对肠道的健康发挥重要作用。肠道中D-乳酸含量和DAO活性的降低标志肠道通透性增加,肠黏膜屏障功能受损[33]。本研究中,与Con组相比,LPS组D-乳酸含量显著降低,表明LPS攻毒使大鼠肠道通透性增加,屏障功能受损。与LPS组相比,D-乳酸含量和DAO活性在Thy × RosA组中显著升高,表明百里香酚和迷迭香酸组合能够缓解LPS攻毒引起的肠黏膜损伤,降低肠道通透性,增强肠道屏障功能。紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、Claudin-1常作为检验肠道紧密连接功能的重要指标。ZO-1、Occludin、Claudin-1可调节上皮屏障,保护肠道黏膜的完整性,阻止肠道中病原体和有害物质向细胞膜内转移和侵袭[34-35]。本研究中,与LPS组相比,ZO-1、Occludin、Claudin-1基因mRNA表达量在Thy × RosA组显著提高,且在Thy × RosA组表达量高于或显著高于Thy组和RosA组。此结果表明百里香酚和迷迭香酸组合可显著提高大鼠盲肠黏膜的紧密连接功能,且百里香酚和迷迭香酸组合的紧密连接功能优于Thy组和RosA组。

肠道内炎症因子水平可反映肠道的免疫状态。促炎因子和抑炎因子在肠道炎症和免疫调节中发挥着重要作用。IL-1β作为重要的促炎因子,可参与机体的免疫反应和信号传导,被认为是炎症反应的启动剂[35-36]。IL-6由2型辅助(Th2)细胞分泌,可调节先天性和获得性免疫[37]。TNF-α是一种高度促炎性的细胞因子,可促进白细胞向感染部位募集以及内皮细胞的活化[38-39]。IL-10由适应性免疫细胞分泌,具有免疫调节作用[40]。本研究中,与LPS组相比,百里香酚和迷迭香酸组合显著降低了促炎因子IL-1β和 IL-6 水平,且有降低促炎因子TNF-α水平,提高抑炎因子IL-10水平的趋势。因此,以上结果表明百里香酚和迷迭香酸组合通过抑制炎症因子的分泌来缓解盲肠的炎症反应。这可能与百里香酚和迷迭香酸的药理作用和对肠道菌群结构的调节有关。有研究表明,百里香酚可以通过阻断细胞中IκBα、NF-κBp65、细胞外信号激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)的磷酸化,从而抑制Toll样4受体(TLR-4)介导的NF-κB通路的表达来发挥抗炎作用[41]。迷迭香酸的抗炎作用可能与抑制ERK、JNK、NF-κB等通路的激活有关[42]。此外,百里香酚和迷迭香酸也能通过调节盲肠的菌群结构,协助潜在益生菌(乳酸杆菌、Romboutsia等)的定殖和促进短链脂肪酸的产生来抵御病原微生物的入侵,提高机体免疫力,缓解盲肠的炎症反应。

综上所述,百里香酚和迷迭香酸组合增加了盲肠中乳酸杆菌、Romboutsia和Turicibacter等细菌的相对丰度,降低了Alistipes的相对丰度,提高了代谢产物短链脂肪酸的浓度。此外,百里香酚和迷迭香酸组合能通过降低肠道通透性,提高盲肠黏膜的紧密连接基因的mRNA相对表达量来提高肠道屏障功能,并有助于缓解肠道炎症反应,且效果优于单一添加的百里香酚组或迷迭香酸组。