HPTLC-DPPH显色-像素分析快速测定酚类抗氧化剂：以食用油和烘焙食品中TBHQ为例

卫 晓,席兴军,李 慧,王小三，黄丹菲，徐学明，陈启飞,黄晓倩,陈益胜

(1.江南大学 食品学院，江苏 无锡214122; 2.中国标准化研究院，北京 100191； 3.中国农业科学院 油料作物研究所，武汉 430062; 4.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，南昌 330047)

自由基链式反应引起的油脂氧化是造成食用油以及面包、蛋糕等富油脂食品在加工储藏过程中品质劣变的主要原因之一，其除了对感官产生严重负面影响的酸败气味外，氧化过程中产生的副产物(如醛和酮)具有潜在的致癌和致畸变毒性，对人体健康危害极大。为了抑制油脂氧化，延长货架期，通常会向油脂和食品配料中添加一定量的抗氧化剂。值得注意的是，大量毒理学研究结果表明过量的酚类抗氧化剂可能对人体健康有严重的负面作用。例如：Schilderman等[1]研究发现，丁基羟基茴香醚(BHA)及其醌代谢产物在人体细胞内代谢过程中产生的氧化应激可能是BHA毒性和致癌性所必需的遗传和细胞损伤的原因；高剂量叔丁基对苯二酚(TBHQ)会导致实验动物产生胃肿瘤前兆和DNA损伤[2-3]；高浓度的2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)可作为动物组织中肿瘤的诱发剂或促进剂，并且具有一定的致癌性[4]。在现有毒理学研究数据的基础上，欧盟食品安全部发布了一系列法规(Directive 95/2/EC, 94/35/EC以及2006/52/EC)限制酚类抗氧化剂的滥用，我国GB 2760—2014也对酚类抗氧化剂的使用限量(≤200 mg/kg)和应用范围有严格的规定。

目前，酚类抗氧化剂的测定方法有很多，其中最常用的是高效液相色谱[5-6]、气相色谱[7-8]等柱色谱法，尽管这些方法灵敏度和准确度高，但对样品前处理要求较高，并且测定时间长，单次只能测定单一样品，无法实现大量样品的快速筛检。相反，仪器化的高效薄层色谱法(High performance thin layer chromatography, HPTLC)具有前处理简单、高通量、兼容性好、快速准确的特点，是一种理想的替代方法。此外，HPTLC-DPPH联用法是酚类抗氧化剂检测中极有潜力的一种简便的分析方法。Rocamora等[9]通过HPTLC联合微量化学(DPPH、对茴香醛和氯化铁)衍生化或生物化学(α-淀粉酶、乙酰胆碱酯酶)衍生化快速评估了成分高度复杂的几种植物精油的抗氧化活性、多酚含量和 AChE 抑制活性。Ibrahim等[10]将HPTLC色谱板用Folin-Ciocalteu试剂衍生后联用DPPH分析法成功应用于测定苜蓿种子萌发11 d期间多酚含量与自由基清除能力的相关性，并通过比较3种不同的图像分析软件确定采用Image J软件进行图像的定量分析，其在精密度、准确度和灵敏度方面有着较明显的优势。

在前期的研究中，我们曾提出了以HPTLC为平台，结合光密度扫描仪对DPPH显色结果进行扫描定量分析的方法[11-12]，并将其纳入国家标准(计划号：20205075-T-424)中。不过这一方法在实际应用中遇到了仪器(光密度扫描仪)价格昂贵和通用性差的问题。使用数码相机对HPTLC结果进行数字化成像是其他色谱工具所不具备的独特优势，这一分析方法不仅为分析者提供了关于色谱分离结果最直观的视觉印象，也使得基于像素灰度分析定量替代昂贵的光密度扫描仪成为可能。目前，很多专业的图像分析软件不断被应用到这一领域，其中Image J是一个基于java的公共的专业图像处理软件，该软件不仅可以免费使用，并且操作简便、功能齐全、兼容性强、可编程，因此是用于HPTLC图像像素分析的理想工具。

本文创新性地建立了高效准确检测食用油、烘焙食品中抗氧化剂TBHQ的方法，解决了酚类抗氧化剂常规检测方法存在的问题，并且使用图像数字化处理软件Image J代替衍生硅胶板常用的HPTLC定量搭配仪器光密度扫描仪，达到显著的经济节约目的，为粮油食品中各种抗氧化剂的快速定量筛查提供了方法依据，可推动相关快速筛检领域的发展。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 原料与试剂

TBHQ标准品(纯度>99%，分析纯)，中国上海阿拉丁公司；TLCF254硅胶板(分析型，序列号HX61210829，规格10 cm× 20 cm)，德国Merck公司；面包、蛋糕(经实验测试确定未添加TBHQ)，江南大学忆江南糕点房；稻米油、大豆油(经实验测定确定未添加TBHQ)，江南大学国家工程实验室提供。

1.1.2 仪器与设备

MB104E型电子天平，瑞士Mettler-Toledo公司；ChromaSpray I 型点样仪，自制；ADC-2型全自动HPTLC展开仪、TLC-scanner 3薄层色谱扫描仪，瑞士CAMAG公司；DD70型HPTLC成像仪，德国Biostep公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的配制

精确称取(10.0±0.1)mg TBHQ标准品，溶于甲醇并定容至10 mL，得到1 mg/mL TBHQ标准储备液，置于棕色容量瓶中，在4℃冰箱中恒温避光保藏，保质期1周。准确吸取1 mL TBHQ标准储备液，与9 mL甲醇混合，得到0.1 mg/mL TBHQ标准溶液，需现用现配。

1.2.2 样品的制备

称取1 g面包或蛋糕样品，与5 mL乙醇混合，将混合物在涡旋混匀器上振荡1 min，然后以5 000 r/min离心5 min，取上清液，用注射器过0.45 μm纤维素滤膜去除其中的固体微粒，备用。

1.2.3 硅胶板预洗

实验中使用的所有硅胶板，使用前均需进行预洗前处理。取10 cm × 20 cm的硅胶板放于ADC-2型全自动HPTLC展开缸中，之后将10 mL色谱级甲醇从仪器上部两侧槽中注入展开缸，以其作为流动相进行展开预洗，展开至硅胶板顶端后取出，最后用薄层加热器在120℃下干燥20 min，降至室温后，用锡纸包装并保存于密封袋中备用。

1.2.4 TBHQ的检测

1.2.4.1 HPTLC分离

为了获得定量且可控的点样结果，样品溶液和标准溶液都通过薄层点样仪在0.5 MPa氮气(载气)的协助下以条带状吹扫到硅胶板上。具体参数：条带宽度6 mm，距离硅胶板底边8 mm，进样速度100 μL/s，预排体积0.2 μL。第1个条带中心距离硅胶板左边缘15 mm，所有条带间距通过软件自动计算得出。点样结束后，将原点区域于50℃干燥1 min以除去残留溶剂。点有样品的硅胶板在全自动HPTLC展开仪中进行色谱分离。色谱分离条件：相对湿度控制时间5 min，硅胶板预平衡时间10 min，流动相为乙酸乙酯-氯仿-无水乙醚(体积比1∶8∶1)，展开距离80 mm。待流动相前沿到达预定高度，展开过程自动停止。此后，将硅胶板取出，放在50℃薄层加热器上烘烤3 min，使得残留在硅胶板上的流动相溶剂挥发。

1.2.4.2 DPPH还原变色反应和成像

将完成色谱分离后的硅胶板通过自动浸渍装置浸入DPPH衍生液中，移动速度3 mm/s，停留时间3 s。然后将蘸有DPPH衍生液的硅胶板置于避光处反应20 min。当硅胶板的红棕色背景出现明显的浅黄色抗氧化剂斑点后，使用配备佳能EOS 700D相机的成像系统对衍生后的硅胶板进行成像记录，相机参数设定为白光底部透射光源，自动对焦和校正。

1.2.4.3 光密度扫描定量分析

拍照成像后，使用薄层色谱扫描仪进行光密度扫描定量，扫描参数设置如下：吸光模式，氘灯和钨灯，激发波长252 nm，光栅3.00 mm × 0.30 mm(Micro)，扫描速度20 mm/s，分辨率100 μm/step。数据采集和处理均使用Wincats软件(1.4.4版)。

1.2.4.4 Image J图像分析软件定量

拍照成像后，用Image J软件打开所得图像，将所需的轨道由“矩形”选择工具勾画出来。轨道宽度应进行调整，以保持均匀的带厚度。通过使用“Analyze”下拉菜单，然后选择“Gels”，最后选择“Plot lanes”选项来生成斑点线条轮廓图。使用“Straight line”选择工具绘制所需峰的基线。为每个峰定义封闭区域后，使用“Wand tool”测量峰面积。Image J数字化图片处理流程如图1所示。计算出峰面积与TBHQ浓度之间的线性关系式，进一步计算出样品中TBHQ的含量。

注：(a)File-Open扫描图导入软件；(b)Analyze-Gels-Select first lane(Select first lane)界定目标区域1(2、3、4、5)；(c)Analyze-Gels-Plot lanes生成斑点线条轮廓图；(d)Straight line选择工具绘制基线，Wand tool测量峰面积。

2 结果与讨论

2.1 HPTLC分离条件的优化

在HPTLC分离中，对硅胶板分离效果评估的方法一般是目测检视法。本研究采用ADC-2型全自动HPTLC展开仪进行薄层色谱展开，全自动化的预饱和硅胶板平衡有效避免了“边缘效应”问题。按1.2.4方法，使用不同流动相进行HPTLC分离条件优化。结果表明，在流动相为乙酸乙酯-氯仿-无水乙醚(体积比1∶8∶1)时，TBHQ的比移值(Rf)为0.61，同一轨道上的目标物质与干扰杂质能够实现良好的分离。因此，选择乙酸乙酯-氯仿-无水乙醚(体积比1∶8∶1)为流动相。图2为在最优流动相条件下，按1.2.4方法将0.1 mg/mL TBHQ标准溶液依次点样1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 μL，得到的TBHQ标准溶液薄层展开图及Image J生成的峰图。图2中1～5斑点分别对应TBHQ标准溶液1.5、2.5、3.5、4.5、5.5 μL的点样量。由图2可见，TBHQ标准溶液经HPTLC分离后，再用DPPH浸渍，DPPH均匀分布于整块薄层板上，含有TBHQ的区域(图2中间变色区域)由浅紫色变为浅黄色，而其他区域则保持浅紫色不变。

注： 1～5 TBHQ浓度分别为150、250、350、450、550 ng/zone。

2.2 定性分析

采用目测检视法进行定性分析。目测检视法可以获得关于HPTLC分离效果和目标物浓度范围最为直观的印象，是最有效的评估方法。不同样品薄层展开图及光密度扫描峰图如图3所示。

注：1.面包样品1； 2.面包样品1+TBHQ标准溶液； 3.面包样品2； 4.面包样品2+TBHQ标准溶液； 5.TBHQ标准溶液(0.1 mg/mL)； 6.蛋糕样品1； 7.蛋糕样品1+TBHQ标准溶液； 8.蛋糕样品2； 9.蛋糕样品2+TBHQ标准溶液； 10.TBHQ标准溶液(0.1 mg/mL)； 11.大豆油样品； 12.大豆油样品+TBHQ标准溶液； 13.稻米油样品； 14.稻米油样品+TBHQ标准溶液。样品+TBHQ标准溶液为1 g样品，0.5 mL的1 mg/mL TBHQ溶液与4.5 mL乙醇混合提取液。点样量4 μL。

由图3可知，未添加TBHQ的面包、蛋糕样品中，TBHQ位置无明显信号产生，且光密度扫描结果显示此类位置无吸收峰，这表明样品提取物中共存的背景基质对目标物定量的干扰可以忽略，证明了该方法具有良好的选择性。TBHQ标准溶液和混合溶液(样品+TBHQ标准溶液)分离后的条带位于同一水平(Rf=0.61)，表明该水平位置为同种物质TBHQ。这里要强调薄层色谱分离的重要性，其可以将样品或标准品的杂质部分与目标物分离，以避免假阳性现象，同时也将样品或标准品中其他类抗氧化物质与目标物分离，以避免产生协同增效作用，降低系统误差。

2.3 定量方法验证

2.3.1 方法检测限(LOD)和线性关系

根据《食品检验工作规范》(食药监科〔2016〕170号)第十九条要求，需要建立具有良好线性的检测方法；而在实际应用中，方法的定量限(LOQ)/LOD和其选择性至关重要。在150～550 ng/zone的范围内对TBHQ进行曲线的绘制，将斑点TBHQ浓度与Image J测定计算的相应斑点光密度峰面积值分别作为标准曲线的横坐标和纵坐标，结果如图4所示。

图4 薄层板上TBHQ浓度与DPPH变色反应的信号关系曲线

由图4可见，对衍生结果的Image J软件分析检测给出了良好的线性结果，R2为0.989 2。随后根据DIN 32645方法计算得到方法的LOD和LOQ，其置信度超过95%，计算结果LOD为70 ng/zone, LOQ为140 ng/zone，以上样量10 μL计算，LOD为35 mg/kg,LOQ为70 mg/kg。

2.3.2 方法精密度和准确度

将1 g样品与0.5 mL TBHQ标准溶液(0.2、0.4 mg/mL)、4.5 mL乙醇混合提取得到2种加标溶液，通过测定目标物TBHQ的加标回收率(分别进行了2个水平实验，每个添加水平重复3次)对本方法的精密度和准确度进行验证，结果如表1所示。

由表1可见，4种谷物烘焙样品和2种食用油样品中TBHQ的加标回收率在93.5%～114%之间， 相对标准偏差均小于10%，这说明本方法具有良好的准确度和精密度。

表1 方法的精密度和准确度

2.3.3 与国标方法的对比

根据GB 5009.32—2016和GB/T 21512—2008食品及食用植物油中TBHQ检测方法的LOD为0.5～10 mg/kg，虽然本方法的LOD比国标方法高，但本方法的LOQ小于GB 2760—2014规定的使用限量(200 mg/kg)，且方法精密度符合国标要求。

3 结 论

本文通过图像分析软件建立了薄层硅胶板上TBHQ与DPPH变色反应的浓度与图像分析得到的峰面积值之间对应关系的标准曲线，随后使用Image J软件对样品色谱显色图进行精确检测。结果显示，所建方法检测限和定量限分别为70 ng/zone(35 mg/kg)、140 ng/zone(70 mg/kg)，在150～550 ng/zone范围内得到R2为0.989 2的线性关系曲线，93.5%～114%的加标回收率和小于10%的精密度，证明了本方法具有可行性，适合粮油食品中各种抗氧化剂的快速定量筛查，具有凝炼成为相关领域国家标准的潜力和价值。